Informations déduites du spectre de masse

4.1.Conformation de la protéine

Lorsqu’on analyse une biomolécule en conditions non dénaturantes (tampon ammonium avec pH et force ionique contrôlés), sa conformation native est préservée. Par conséquent, dans cet état replié, moins d’acides aminés sont accessibles pour être protonés que dans un état déplié.

En conditions dénaturantes, comme par exemple dans une solution d'eau et d'acétonitrile acidifiée avec de l’acide formique, à pH 3, la protéine est dans un état déplié avec un nombre de résidus accessibles moyen plus élevé. Le nombre de charges effectives d’une protéine en conditions non dénaturantes est ainsi beaucoup plus faible que le nombre observé en conditions dénaturantes. Sur le spectre de masse, on détecte ainsi des ions à des m/z plus élevés qui portent moins de charges. Une distribution d’état de charge étroite avec des nombres de charge faibles sera donc caractéristique d’un spectre de protéine obtenu en conditions non dénaturantes. Au contraire, une distribution d’état de charge large avec des nombres de charge élevés sera caractéristique d’un spectre de protéine obtenu en conditions dénaturantes.

Les analyseurs traditionnellement utilisés pour travailler en conditions non dénaturantes seront donc ceux qui possèdent une gamme de masse étendue (supérieure à 4000 m/z), en particulier l’analyseur à temps de vol (TOF). De nombreux instruments avec source ESI sont néanmoins couplés à des quadrupoles ou des trappes ioniques, mais il faut garder à l’esprit que leur gamme de m/z limitée peut constituer un obstacle technique à des applications MS non dénaturantes. Ainsi avec une trappe ionique limitée à des ions de m/z de 3000, on ne peut en général analyser des systèmes dont la masse dépasse 30 kDa.

4.2.Spécificité de l’interaction observée

Comme cela est détaillé par Smith et al., en 1995, différents contrôles peuvent être réalisés pour affirmer qu’une interaction non-covalente est spécifique (138) :

Ͳ L’ajustement des conditions à l’interface ne doit pas modifier la stœchiométrie.

Ͳ Le complexe doit se dissocier suite à des modifications de conditions en solution (pH, température, tampon, …).

Ͳ Le complexe doit se dissocier lorsqu’on varie les paramètres de l’interface, en d'autres termes, des conditions plus dissociantes doivent entraîner la rupture du complexe non covalent.

Ͳ La formation du complexe doit être sensible à des modifications de l’un des partenaires du complexe.

4.3.Stœchiométrie apparente du complexe

Le nombre de ligands liés à la protéine en phase gazeuse est obtenu facilement avec l’équation : ௠ሺ௖௢௠௣௟௘௫௘ሻି௠ሺ௣௥௢௧±௜௡௘ሻ

௠ሺ௟௜௚௔௡ௗሻ

Cette stœchiométrie est dite apparente car elle ne reflète pas forcément la saturation du complexe. Seul un titrage stœchiométrique donne accès à la stœchiométrie réelle.

4.4.Constantes cinétiques du complexe

L'avantage unique de l’ESI-MS par rapport aux techniques biophysiques est de fournir directement des données sur toutes les espèces individuelles présentes en solution, grâce à la mesure précise de leurs masses. De plus, les intensités relatives des différentes espèces observées sur le spectre de masse peuvent servir à estimer l’abondance relative de chacun des composés, et ainsi donner une information sur les affinités relatives en solution. La combinaison de ces deux types d’information, la mesure de masse précise et les intensités relatives des pics, peut être utilisée rapidement pour mettre en évidence une interaction et estimer son affinité relative. De nombreuses interactions moléculaires avec des constantes de dissociation allant du nM au mM ont déjà été caractérisées par ESI-MS (139–143). Nous allons d'abord décrire les paramètres cinétiques usuels d'un complexe.

4.4.1. Constante d’équilibre de dissociation (KD) 4.4.1.1. Définition

L'équation la plus simple décrivant la formation réversible d’un complexe protéine –ligand est la suivante :

L’équilibre est atteint lorsque les concentrations des espèces ne changent plus, ou quand la vitesse d'association du ligand à la protéine est égale à la vitesse de dissociation du complexe :

ሾ 3 ሿ ሾ / ሿ N

ሾ 3/ ሿ N

Soit

^RII

^RQ

ൌ

ሾ3/ሿ

ൌ .

KD est la constante d’équilibre de dissociation, elle s’exprime dans la dimension d'une concentration molaire, en unités M. KD est inversement reliée à l’affinité d’une protéine pour un ligand, et quand la concentration en ligand est égale au KD, la protéine est saturée à 50%.

4.4.1.2. Détermination du KD par MS

La technique de détermination du KD par ESI-MS est basée sur la détection et la quantification directe des ions PL (complexes protéine-ligand) et P (protéine libre) en phase gazeuse. Le principe de base est donc que la fraction de liaison (fbound) mesurée par MS est égale à la fraction de liaison à l’équilibre en solution.

L’équation quadratique classique établit une relation entre fbound, le ratio de la concentration en protéine liée sur la concentration totale de protéine, qui constitue la variable mesurée, KD, la constante de dissociation à l’équilibre du complexe protéine-ligand, qu’on cherche à déterminée, et [P]0 et [L]0, respectivement les concentrations initiales en protéine et ligand :

I

ሾ3ሿ

ሾ3ሿሾ/ሿ.'ିටሺሾ3ሿሾ/ሿ.'^మିସሾ3ሿሾ/ሿ

ଶሾ3ሿ

Wн> W>

Ŭ_ŽŶ Ŭ_ŽĨĨ

Formation (2^nd ordre)

Dissociation (1^er ordre)

Le KD peut être déterminé par une régression non-linéaire sur les données [L]0 et fbound en utilisant l’équation quadratique classique, où [L]0 est la variable entrée en abscisse et fbound, la variable entrée en ordonnée.

4.4.2. Constante de vitesse de dissociation (k_off)

koff est la constante de 1^er ordre de dissociation, elle s’exprime en s^-1. koffest directement relié au temps de demi-vie du complexe :

ݐ

ൌ

೚೑೑

Ce temps t1/2 correspond au temps au bout duquel 50% du complexe initialement présent est dissocié.

4.4.3. Constante de vitesse d’association (kon)

kon est la constante d’association bimoléculaire de 2^ème ordre, elle s’exprime dans la dimension d'une concentration par unité de temps, en unités M^-1. s^-1. Cette constante a une limite supérieure due au fait que deux molécules doivent d’abord diffuser et se rencontrer avant de pouvoir interagir. Pour deux molécules en diffusion libre, ç.à.d. se déplaçant librement en solution par mouvements browniens, la valeur maximale pour kon, en d'autres termes la limite de diffusion, est d’environ 1.10⁸ à 1.10⁹ M^-1. s^-1(144).