II. 1.18) Péonidine 3-O-(6-p-coumaroyl)-glucoside
II.2) Stilbènes
Nous avons étudié trois stilbènes : le resvératrol, qui est la seule molécule pour laquelle des études ont été faites précédemment pour connaître son devenir suite à l’infestation par le Botrytis cinerea, le picéide ou resvératrol 3-O-glucoside, dérivé monoglycosylé du resvératrol et la pinosylvine qui est une toxine qui permet de lutter contre les infections fongiques.
II.2.1) Resvératrol
Le resvératrol a une masse en spectrométrie de masse positive de 229,089 g/mol (Fig. 45.). On peut expliquer six fragments que l’on a retrouvés parmi les ions obtenus par fragmentation (Annexe
29) correspondant au spectre obtenu en MS/MS (Fig. 46.)
Fig. 45. Structure du resvératrol
69 On peut voir que le resvératrol est la molécule présente en plus grande quantité dans le tissu infesté parmi toutes les molécules étudiées (Tab. 26.). Il est également important de noter que le resvératrol n’est pas présent dans la pellicule de raisin saine.
Tab. 26. Quantités retrouvées de resvératrol
II.2.2) Picéide
La picéide a une masse de 391,144 g/mol en spectrométrie de masse positive (Fig. 47.). On retrouve neuf fragments parmi les ions obtenus par fragmentation (Annexe 30) suivant le spectre obtenu en MS/MS. (Fig. 48.)
Fig. 47. Structure de la picéide
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 Infesté Témoin
Resvératrol
70
Fig. 48. Spectre obtenu en MS2 pour une masse de 391.150 g/mol
On assiste au phénomène inverse que pour le resvératrol : la picéide est présente dans la pellicule de raisin saine mais est totalement absente de la pellicule infestée par le Botrytis. (Tab. 27.)
Tab. 27. Quantités retrouvées en picéide
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Infesté Témoin
Picéide
71
II.2.3) Pinosylvine
La pinosylvine a une masse de 213,094 g/mol, soit la plus petite masse étudiée ici en spectrométrie de masse positive (Fig. 49.). On peut expliquer trois fragments à l’aide des ions obtenus par fragmentation (Annexe 31) selon le spectre obtenu en MS/MS. (Fig. 59.)
Fig. 49. Structure de la pinosylvine
Fig. 50. Spectre obtenu en MS2 pour une masse de 213.095 g/mol
D’un point de vue quantitatif, on peut voir que bien que ce soit le seul stilbène étudié qui est présent dans la pellicule infestée et dans la saine, la pinosylvine est beaucoup plus présente dans la pellicule infestée que dans la pellicule saine, ce qui semble logique au vu de son rôle dans la défense contre les infections fongiques. (Tab. 28.)
72
Tab. 28. Quantités retrouvées de pinosylvine
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Infesté Témoin
Pinosylvine
73
III) Discussion
Grâce à l’ensemble des résultats ci-dessus, nous avons pu identifier de nombreuses molécules, même si pour celles ayant des masses identiques ou similaires, il est difficile de savoir exactement laquelle des deux molécules est réellement présente, si ce n’est les deux. Par rapport à ce que l’on a pu voir des études précédentes (cf. Contexte bibliographique, partie IV) ), on peut voir que toutes les molécules que l’on a retrouvées sont bien connues et retrouvées dans la plupart des cépages (à part les dérivés acétylglucosides et pcoumaroylglucosides pour les Pinots (26,28)).
On peut remarquer différentes informations nouvelles sur l’effet du Botrytis sur la pellicule du grain de raisin, d’un point de vue semi-quantitatif :
- à l’exception du couple kaempférol / quercétine, tous les aglycones sont entre trois et quatre fois plus nombreux dans la pellicule saine que dans la pellicule infestée par le Botrytis ;
- concernant les dérivés monoglucosés, on remarque deux comportements possibles : soit les quantités sont sensiblement les mêmes, soit les quantités retrouvées dans l’échantillon infesté est beaucoup plus important que dans le sain ;
- il n’y a pas de comportement général pour les dérivés acétylglycosylés et pcoumaroylglycosylés ;
- pour les stilbènes, on retrouve ce qui a déjà été évoqué dans la littérature, c’est-à-dire que le resvératrol n’est présent que dans le tissu infesté, ce qui montre bien qu’il a un rôle important dans la lutte contre l’infestation puisqu’on voit également que c’est la molécule étudiée retrouvée avec la plus grande quantité. La picéide est quant à elle uniquement présente dans le tissu sain, ce qui laisse supposer, puisque c’est le monoglycoside de resvératrol, que le Botrytis cinerea agirait en séparant le sucre du resvératrol, expliquant également ce que l’on disait auparavant à propos du resvératrol. Enfin la pinosylvine est plus présente dans l’échantillon infesté, ce qui semble logique puisque cette molécule est synthétisée avant l’infection par le Botrytis par le grain de raisin pour s’en défendre.
74
Fig. 51. Carte de chaleur
Nous avons également établi une carte de chaleur suivante (Fig. 51.) qui nous permet de voir qu’il y a bien une différence notable entre les quantités retrouvées dans le tissu infesté et dans le tissu sain, pour toutes les molécules étudiées à l’exception du kaempferol et de la cyanidine puisque pour ces molécules on retrouve des quantités réellement proches entre les deux échantillons. Il y a également quelques résultats proches pour les dérivés monoglycosylés de cyanidine et de kaempférol.
75
Conclusion
Grâce à la spectrométrie de masse associée à la chromatographie liquide, nous avons pu identifier de nombreuses molécules et l’effet qu’avait le Botrytis sur la quantité retrouvée pour chacune de ces molécules. Nous avons pu ainsi prouver par exemple que le resvératrol était uniquement retrouvé dans l’échantillon infesté, ce qui semblait prouver son rôle dans la lutte contre l’infestation fongique dans le raisin.
Nous avons pu également découvrir des nouveaux effets du Botrytis sur les composés phénoliques, comme par exemple la diminution des quantités retrouvées en aglycones de flavonoïdes et d’anthocyanes (à une exception près).
76
Conclusion générale
Jusqu’à présent, les études concernant Botrytis cinerea n’apportaient que très peu d’informations sur son effet au niveau microscopique des plantes. Nous étions limités à son effet sur le resvératrol, stilbène qui est connu comme étant le moyen de défense du raisin contre l’infestation fongique.
Grâce à l’identification par spectrométrie de masse, nous avons pu reconnaître une trentaine de molécules appartenant à trois familles : les flavonols, les anthocyanes et les stilbènes. Ainsi, nous avons vérifié les études précédentes sur le resvératrol et nous pouvons émettre l’hypothèse d’une séparation du sucre de la picéide, aussi connue sous le nom de resvératrol 3-O-glucoside. Cette étude a également permis de discerner des différences entre les pellicules des grains de raisin infestées ou non pour d’autres molécules.
Des études complémentaires seront nécessaires pour mieux comprendre le mode d’action du champignon pour modifier à ce point la composition phénolique de la pellicule.
L’intérêt de ces composés dans le milieu pharmaceutique n’est pas récent avec l’utilisation du resvératrol comme anti-oxydant dans des crèmes (par exemple chez Caudalie), ou des flavonoïdes et des anthocyanes pour leurs effets sur les pathologies vasculaires (l’utilisation de la vigne rouge pour les jambes lourdes ou les hémorroïdes le prouve).
On remarque donc que l’environnement et ici la présence d’un agent pathogène comme un champignon affecte la composition du raisin et de la vigne en général, ce qui peut se révéler intéressant ou au contraire un handicap pour l’extraction d’un maximum de composés d’intérêt pharmaceutique.
77
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80
Annexes
Annexe 1 : Quantités retrouvées pour les molécules d’intérêt étudiées
Molécules
Infesté
Moy ET
Témoin
Moy ET
Quercétine & Delphinidine
199,25
45,53
642,86
93,45
Kaempférol & Cyanidine
65,40
1,90
59,07
9,99
Isorhamnétine & Pétunidine
41,83
3,81
96,40
13,82
Myricétine
68,40
11,57
280,09
39,84
Péonidine
30,03
5,14
148,15
4,88
Myr 3-O-glucoside
1,75
0,20
429,37
26,60
Myr 3-O-glucuronide & Lar 3-O-glucoside
523,14
17,08
1,93
0,15
Mv 3-O-glucoside & Iso 3-O-glucuronide
30,76
3,38
24,35
0,84
Cy 3-O-glucoside & Ka 3-O-glucoside
79,40
7,93
89,72
6,35
Del 3-O-glucoside & Qu 3-O-glucoside
2340,58
70,41
6,56
0,41
Pt/Iso 3-O-glucoside & Qu 3-O-glucuronide
2692,80
149,92
3151,76
126,53
Pn 3-O-glucoside & Ka/Cy 3-O-glucuronide
5164,22
322,01
4341,01
309,76
Cy 3-O-acétylglucoside
0
0
66,15
5,98
Del 3-O-acétylglucoside
7,70
1,12
251,67
34,65
Pn 3-O-acétylglucoside
29,30
3,60
2,18
0,03
Pt 3-O-acétylglucoside
29,79
1,79
69,00
2,18
Del 3-O-pcoumaroylglucoside
183,62
13,87
288,41
19,68
Pn 3-O-pcoumaroylglucoside
25,48
7,86
1,84
0,09
Resvératrol
24334,71
4462,38
0
0
Picéide
0
0
163,73
2,85
Pinosylvine
367,59
30,29
4,22
0,07
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
Annexe 9 : Principaux ions obtenus lors de la fragmentation de la laricitrine 3-O-glucoside
93
Annexe 11 : Principaux ions obtenus lors de la fragmentation de la delphinidine 3-O-glucoside
94
Annexe 13 : Principaux ions obtenus lors de la fragmentation de la malvidine 3-O-glucoside
95
96
97
Annexe 17 : Principaux ions obtenus lors de la fragmentation de la pétunidine 3-O-glucoside
98
99
100
Annexe 21 : Principaux ions obtenus lors de la fragmentation du kaempférol 3-O-glucuronide
101
Annexe 23 : Principaux ions obtenus lors de la fragmentation de la cyanidine 3-O-(6”acétyl-
102
Annexe 24 : Principaux ions obtenus lors de la fragmentation de la delphinidine 3-O-(6”acétyl-
103
Annexe 25 : Principaux ions obtenus lors de la fragmentation de la pétunidine 3-O-(6”acétyl-
104
Annexe 26 : Principaux ions obtenus lors de la fragmentation de la péonidine 3-O-(6”acétyl-
105
Annexe 27 : Principaux ions obtenus lors de la fragmentation de la delphinidine 3-O-(6-p-coumaroyl)-
106
Annexe 28 : Principaux ions obtenus lors de la fragmentation de la péonidine 3-O-(6-p-coumaroyl)-
107
108
109