Les stilbènes

Les stilbènes présentent une structure en C6-C2-C6 (Tableau I), avec un cycle A portant deux fonctions hydroxyles en position méta et un cycle B portant des fonctions hydroxyles ou méthoxyles en méta, ortho et para. Ils sont synthétisés à partir de dérivés d’acides cinnamiques dont la substitution déterminera celle du cycle B. La molécule la plus courante et la plus étudiée est le resvératrol (3,5,4’-trihydroxystilbène) qui existe sous forme cis ou trans (Figure 25). Cependant, la forme trans est majoritaire et les dérivés conjugués tels que le trans- resvératrol-3-O-glucoside, peuvent être également présents. Les sources principales de stilbènes sont le raisin et son jus, les cacahuètes et le beurre de cacahuètes (262), le chou rouge, les épinards et certaines plantes médicinales (233). La concentration en stilbènes dans le vin est en partie déterminée par les étapes de macération avec la peau et les pépins de raisin. Ainsi, c’est dans le vin rouge que l’on en mesure la plus grande quantité avec une concentration jusqu’à 8 mg/L selon les variétés (263). Le jus de raisin rouge contient 0,7 à 14 mg/L de resvératrol et le jus de raisin blanc environ 1,4 mg/L. Dans les jus, les formes glycosylées représentent plus de 90% du resvératrol (223, 241).

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HO

OH HO

Figure 25 : Structure chimique du resvératrol

1.6.3.4 Les lignanes

Une dimérisation oxydative de deux unités de phénylpropane permet la formation de la lignane (Figure 26). Il y a peu de lignane dans les fruits et les légumes comparativement à ce qui est retrouvé dans la graine de lin. Selon les études, il y en aurait dans le blé, les légumineuses, les poires, les prunes et les petites baies (264) et elle y compterait environ 1000 fois moins que dans la graine de lin où une concentration de 3,7 g/kg de poids sec a été estimée (265, 266). La flore colique métabolise les lignanes en entérodiol et en entérolactone, et leur structure chimique est comparable aux phytoestrogènes.

CH2OH CH2OH H3CO HO OH OCH3

Figure 26 : Structure chimique de la lignane

1.6.4 Biodisponibilité

Les polyphénols sont présents dans notre alimentation sous plusieurs formes (267- 271). Cette particularité va leur conférer des types de métabolisme différents. La biodisponibilité des polyphénols dépend de trois facteurs essentiels : la capacité de transport à travers la bordure en brosse des entérocytes, l’intensité de la sécrétion intestinale des

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polyphénols conjugués vers le sang et la capacité de la sécrétion biliaire. Les polyphénols présentent une faible biodisponibilité avec une élimination lente qui diffère d’un polyphénol à l’autre. En effet, les polyphénols peuvent être absorbés par l’intestin dans leur forme aglycone ou encore être conjugués par méthylation, sulfatation ou glucuronidation (Figure 27). Une partie de ces polyphénols est déversée dans le sang tandis qu’une autre est destinée à poursuivre le transit vers le grêle et le côlon, ce qui représente l’un des mécanismes de contrôle de l’absorption intestinale des polyphénols. Dans le sang, les polyphénols ne sont pas présents sous leur forme native car ils ont été modifiés à cause de leur transformation au niveau du foie et des cellules intestinales. La fraction des polyphénols conjugués, destinée finalement aux différents tissus, pourrait résulter en un effet biologique potentiel ou être éliminée dans les urines. Cependant, d’autres polyphénols conjugués pourraient être déversés dans l’intestin via la bile et y être hydrolysés par des enzymes de la flore intestinale libérant ainsi de nouveaux aglycones. Ce recyclage entérohépatique des polyphénols permettrait de maintenir une concentration de polyphénols non négligeable dans le sang (223, 272-274).

Figure 27 : Métabolisme intestinal des polyphénols chez l’humain

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Le tractus gastro-intestinal est responsable de l’absorption, de la transformation des aliments, de leur dégradation en protéines, en glucides, en sels minéraux, en oligo-éléments, en lipides et en d'autres substances utilisables par l'organisme. Il assure également le passage de ces nutriments dans la circulation sanguine de façon à ce qu'ils puissent être employés par l’ensemble des organes. Ces substances constituent les matières premières pour la fabrication, la réparation et le contrôle des différents systèmes de l'organisme. La section suivante a pour objectif d’élucider le devenir des flavonoïdes dans l’intestin par l’étude des différents mécanismes d’absorption, d’excrétion vers la lumière intestinale, de conjugaison, de métabolisation par la microflore et d’élimination. Étant donné que les fruits et légumes contiennent principalement des flavonoïdes, seule cette sous-classe est présentée dans ce présent travail. Un schéma des mécanismes majeurs impliqués dans la métabolisation intestinal des flavonoïdes est illustré à la fin de cette section (Figure 28).

1.6.4.1 Absorption

Les propriétés bioactives des flavonoïdes dépendent principalement de leur absorption au travers de la paroi gastro-intestinale. Les flavonoïdes provenant de l’apport alimentaire, tels que la pomme et la canneberge, se retrouvent en général sous forme de glycoside, d’esters ou de polymères. Les glycosides des flavonoïdes résistent au pH acide et ne sont donc pas absorbés par la paroi stomacale sauf pour les formes aglycones qui sont rapidement absorbées dans l’estomac et l’intestin grêle (272). Les flavonoïdes, excepté les flavan-3-ols, sont glycosylés le plus souvent par une molécule de glucose, de rhamnose, d’arabinose, de xylose, de rutinose, de galatose et même de sophorose. Cette glycosylation des polyphénols ne permet pas à ces derniers de traverser la membrane plasmique des entérocytes par diffusion passive à cause de leur caractère polaire. Une étape de déglycosylation catalysée par une enzyme est essentielle à l’absorption des flavonoïdes par les entérocytes. La première voie de déglycosylation fait intervenir une glucosidase présente au niveau de la bordure en brosse de l’intestin grêle, la lactase phloridzine hydrolase (LPH). Cette enzyme catalyse l’hydrolyse extracellulairement des glucosides, permettant ainsi aux flavonoïdes de traverser passivement, sous forme aglycone, la membrane plasmique des entérocytes grâce à leur caractère lipophile (276). La LPH présente une affinité pour les substrats tels que les flavonoïdes-O--glucosides.

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La deuxième voie de déglycosylation fait intervenir un transporteur de glucose sodium dépendant (SGLT1 : sodium-glucose transport protein 1) qui permet l’entrée des glucosides polaires des flavonoïdes dans les entérocytes par transport actif (273, 277). Par la suite, une β- glucosidase cytosolique située dans les entérocytes hydrolyse les glycosides des flavonoïdes.

Le site et le taux d’absorption des flavonoïdes glycosylés sont dépendants du type de sucre attaché sur ce dernier. La position du sucre, quant à elle, affectera les mécanismes impliqués dans l'absorption intestinale. La position des glycosides sur le squelette carboné des flavonoïdes à la position 3’ et 4’ influence leur absorption. L’équipe de Day et al. en 2003 a montré que la quercétine-3-O-glucoside n’était pas un substrat de la β-glucosidase cytosolique et que ce composé empruntait préférentiellement la voie de la LPH, alors que la quercétine-4’- O-glucoside empruntait les deux voies métaboliques (278). Le kaempferol ayant un groupe 4’- hydroxyle est plus biodisponible que la quercétine, lequel a un groupement 3’,4’-dihydroxyle (279, 280). Par exemple, la 3-hydroxyanthocyane dans les fraises, pélargonidine-3-O- glucoside, est absorbée plus facilement que son analogue en 3’,4’-dihydroxy, la cyanidine-3- O-glucoside (248, 281). Il y a des polyphénols glycosylés par d’autres sucres (rhamnose, arabinose, xylose), des proanthocyanidines ou des esters d’acides phénoliques comme l’acide chlorogénique qui ne sont pas ou peu absorbés au niveau de l’intestin (241). Un exemple qui revient fréquemment dans la littérature est celui de l’absorption de la quercétine glycosylée chez l’humain: le pic d’absorption de la quercétine 4’-glucoside se fait entre 0,5 à 0,7 h alors que celui de la quercétine 3-rutinoside se fait de 6 à 9 h après son ingestion (273). De plus, comme le rutoside n’est pas un substrat de l’enzyme LPH dans la bordure en brosse, la quercétine 3-rutinoside se retrouve intacte dans le côlon.

Ainsi, les flavonoïdes qui ne sont pas absorbés dans l’intestin grêle se dirigent vers le côlon où la microflore peut hydrolyser les glycosides en aglycone grâce à l’action d'enzymes telles que les rhamnosidases, les estérases, etc. La microflore peut également O- et C- déglycosyler, hydrolyser les esters et les amines, et déglucuronider les métabolites produits. Les aglycones libérés sont absorbés au niveau du côlon mais de façon moins importante qu’au niveau de l’intestin où la surface d’échange est bien plus grande ainsi que le nombre de transporteurs (241).

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Les flavan-3-ols sont la seule sous-classe des flavonoïdes qui ne sont pas présents comme glycosides dans le régime alimentaire. L'absorption de la catéchine par l'intestin grêle est directement proportionnelle à la dose apportée par la diète (282). Les données suggèrent que la catéchine pénètre dans les cellules intestinales par diffusion passive, un mécanisme d’absorption qui est généralement proportionnelle à la dose. L’absorption d’oligomères de flavan-3-ols, les procyanidines, a été principalement étudiée dans le modèle cellulaire Caco-2, c’est un modèle communément utilisé pour évaluer les paramètres d’absorption intestinale. L’équipe de Ou et al. ont démontré, en 2012, que les procyanidines dimériques, trimériques et tétramériques de type-A pouvaient être absorbées par la voie paracellulaire via les jonctions serrées des cellules (283). A cause du caractère polaire des procyanidines, le transport passif se fait par voie paracellulaire au lieu transcellulaire. Toutefois, dans cette même année, l’équipe de Zumdick et al. a révélé que les procyanidines sont des substrats pour la p- glycoprotéine, ce qui signifie que les procyanidines de type-B peuvent être transportées par la voie para et transcellulaire dans les cellules Caco-2. Les procyanidines internalisées dans les cellules Caco-2, par voie transcellulaire, s’exposent à de l’efflux diminuant ainsi leur taux d’absorption nette (284).

1.6.4.2 Métabolisme

Les flavonoïdes sont métabolisés dans l’intestin grêle par conjugaison ou dans le côlon par la microflore. Au niveau intestinal, les flavonoïdes peuvent subir trois types de conjugaisons (méthylation, glucuronidation et sulfatation) suite à leur absorption. La méthylation des flavonoïdes est effectuée par la catéchol-O-méthyltransférase (COMT). Cet enzyme catalyse le transfert d'un groupe méthyle de la S-adénosyl-L-méthionine au flavonoïde ayant un groupement o-diphénolique (catéchol). Cette réaction de conjugaison est bien connue à la position 3' de la quercétine et de la catéchine, et elle se produit dans plusieurs tissus autres que l’intestin (35). La seconde conjugaison est la glucuronidation produite par l’UDP- glucuronosyltransférase (UDPGT). Cet enzyme lié aux membranes du réticulum endoplasmique catalyse cette fois-ci le transfert d’un acide glucuronique de l’acide UDP- glucuronique vers le flavonoïde. La sulfatation des flavonoïdes est la troisième conjugaison possible dans l’intestin. La sulfatation est réalisée par des sulfotransférases (SULT), présentes

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dans le cytosol de la cellule intestinale, qui catalysent le transfert d’un groupement sulfate de la 3’-phosphoadénosine-5’-phosphosulfate sur les groupements hydroxyles des flavonoïdes.

La proportion de chacune des trois réactions de conjugaison est dépendante de la structure chimique des flavonoïdes et elle est très variable. Ainsi, il est possible d’observer de la quercétine diglucuronidée, de la phlorétine glucuronidée-sulfatée ou encore de la catéchine méthylée-glucuronidée et sulfatée. Le taux de conjugaison des flavonoïdes étant particulièrement élevé, le niveau d’aglycone mesuré du coté basolatéral des cellules Caco-2 ou dans le plasma est relativement faible (241, 285).

Les aglycones non-absorbés dans l’intestin grêle se retrouvent au niveau du côlon où la microflore pourra leur faire subir une ou plusieurs transformations telles qu’une déhydroxylation, une déméthoxylation et une déméthylation aromatique en plus d’une hydrogénation, oxidation et -oxidation des éléments aliphatiques générés après l’ouverture de l’hétérocycle. Les transformations effectuées par la microflore libéreront divers métabolites dont des acides hydroxyphénylacétiques issus du métabolisme des flavonols, des acides hydroxyphénylpropioniques issus du métabolisme des flavones et des flavanones ainsi que des phénylentérolactones et des acides hydroxyphénylpropioniques issus du métabolisme des flavanols. Ces acides aromatiques sont par la suite eux-mêmes métabolisés en dérivés d’acide benzoïque (241). Il est rare que les études quantifient les produits non-aromatiques (l’oxaloacétate, le CO2) résultant de ces réactions. Pourtant, ils ne sont pas négligeables car la principale étape du catabolisme des flavonoïdes est la rupture du cycle A et la perte des carbones 5 à 8 comme l’acide oxaloacétique qui est lui-même utilement métabolisé en CO2. Ces métabolites peuvent être absorbés au niveau du côlon (286). Par conséquent, les acides phénoliques ou aromatiques générés dans le tractus gastro-intestinal sont indépendants des classes de polyphénols provenant des aliments consommés. Les anthocyanes et les proanthocyanidines vont produire les acides benzoïques (C6-C1) dont les acides protocatéchique (3,4-dihydroxybenzoïque) et 4-hydrobenzoïques et aussi les acides phenylpropionates (C6-C3) dont les acides dihydrocaféique et dihydroférulique, avec quelques acides phenylvalérique (C6-C5)--OH lors du début de la dégradation des proanthocyanidines. De plus, il y aurait une augmentation des acides benzoïques vers la fin étant donné que la microflore ou les systèmes enzymatiques vont réduire la chaîne latérale. Les acides

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cinnamiques peuvent être absorbés tels quels ou être réduits à des acides dihydro C6-C3; les flavonols peuvent être réduits en acides phenylacétique (C6-C2) et peuvent être formés également suite à une α-oxidation des acides dihydro C6-C3 en les réduisant en acides C6-C1 par le même mécanisme (287). La description de ces groupes de métabolites dans les paragraphes suivants démontre la complexité du métabolisme des flavonoïdes dans un modèle in vivo où la microflore intervient. Il est toutefois important pour les équipe de recherche, travaillant sur le métabolisme des polyphénols, d’en tenir compte puisqu’il y a sans doute une partie de l’activité biologique qui est due à ces métabolites (287).

Acides benzoïques (C6-C1)

Les études avec les cellules Caco-2 ont démontré que les acides benzoïques et les 3 isomères des acides mono-hydroxybenzoïques sont les substrats du transporteur monocarboxylate (288). Suite à leur transport, ils sont métabolisés en conjugués sulfatés et glucuronidés par les cellules Caco-2. Les acides 3-methoxy-4-hydroxy-phénylacétique ou homovanillique sont des substrats pour le transporteur organique anionique des rats (289). Suite à l’absorption, la catechol-O-methyl transferase méthyle l’acide protocatéchique donnant de l’acide vanillique (290).

Acides phenylacétique (C6-C2)

Dans les matières fécales, le contenu du côlon est composé d’acide phénylacétique,

d’acide 3-phenylpropionique, d’acide 3-hydroxyphénylacétique, d’acide 3,4-

dihydroxyphenylacétique, d’acide 3-(4’hydroxyphenyl)-propionique et d’acide 4-hydroxy-3- methoxycinnamique (connu aussi sous le nom d’acide férulique) dont les concentrations moyennes sont 188, 197, 110, 64, 61 et 10 µM, respectivement (291).

Acides phenylpropionate (C6-C3)

L’acide dihydrocaféique est principalement absorbé par diffusion passive transcellulaire ce qui permet son entrée dans la circulation majoritairement sous forme libre. Cependant, une faible proportion d’acide dihydrocaféique est glucuronidé (292). Les acides dihydrocaféiques sont rapidement sulfatés ou méthylés puis sulfatés par le foie alors que les métabolites majoritairement entrant dans la circulation sanguine sont des acides dihydroféruliques libres, acide dihydrocaféique-3-O-sulfate ou acide dihydroférulique-4-O- sulfate. L’acide dihydroférulique est absorbé par l’intestin partiellement par diffusion passive transcellulaire et par transport actif par le transporteur monocarboxylique (292, 293). L’acide

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3-hydroxycinnamique et ses dihydroformes, et l’acide 3-(3’-hydroxyphenyl)-propionique sont les deux absorbés partiellement par le transporteur monocarboxylique dans les cellules Caco-2 (294).

Acides phenylvalérique (C6-C5)

Plusieurs catabolites ont été détectés dans le plasma et les urines comme conjugués méthylés et/ou glucuronidés/sulfatés (295).

1.6.4.3 Efflux

L’efflux intestinal est un mécanisme important qui limite l'absorption de certains flavonoïdes. Une proportion importante de flavonoïdes conjugués formés dans l'intestin grêle est activement retournée à la lumière intestinale. L’interaction de ces molécules avec les transporteurs membranaires MRP (multidrug-resistance-associated protein) et la P-gp (P- glycoprotéine) de la famille ABC (ATP-binding cassette transporters) est impliquée dans l’efflux (296, 297). L'efflux de la quercétine et les métabolites est supposé se produire par MRP2, situé sur le côté luminal des cellules épithéliales (298, 299). La quercétine-3'-O- glucuronide a été excrétée dans la lumière de façon sélective, laissant probablement d'autres métabolites tels que le 3- et 7-O-glucuronides disponibles pour la circulation systémique (300). La proportion de l'efflux intestinal de certains flavonoïdes a été étudiée suite à une perfusion intestinale situ. Par exemple, pour la quercétine 52% de la dose perfusée a été ré- excrétée de retour dans la lumière alors que seulement 10 à 20% de la dose de kaempférol a été de nouveau éliminée (301). La catéchine ne semble toutefois pas être un substrat de choix pour ces protéines de transport, ce qui pourrait expliquer la différence du taux d’absorption entre la catéchine et l’épicatéchine. Par conséquent, la communauté scientifique s’interroge sur les différences d’absorption des flavonoïdes. Est-ce que le taux d’absorption des flavonoïdes dépend davantage de l’interaction des flavonoïdes avec les protéines responsables de l’efflux ou de la quantité de flavonoïdes pouvant être absorbée au niveau intestinal ?

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Où LPH, lactase phloridzin hydrolase; SGLT, sodium-dependent glucose transporter;

MRP, multi resistance-associated protein; Poly, polyphenol.

Figure 28: Schéma représentant les processus d’absorption et de métabolisation des polyphénols dans les cellules Caco-2/15

1.6.4.4 Distribution et élimination

Les flavonoïdes glycosylés ou estérifiés natifs ne sont généralement pas présents dans la circulation sanguine sauf pour les anthocyanines ayant une forme native glycosylée. Les flavonoïdes conjugués issus du métabolisme intestinal et même hépatique sont identifiés dans le sang. La forme glucuronidée des flavonoïdes est le métabolite conjugué principal au niveau sanguin.

Des études menées avec des flavonoïdes marqués (quercétine, épigallocatéchine, quercétine 4’-glucoside, cyanidine 3-glucoside) ont montré que, 1 à 6 heures après l’ingestion, la radioactivité était détectée majoritairement dans la circulation sanguine et les organes du système digestif. Toutefois, les flavonoïdes ont également été détectés dans d’autres organes tels que le cerveau, le cœur, les reins, le thymus, le pancréas et la prostate. Les concentrations

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en polyphénols dans ces tissus étaient de 30 à 3000 ng d’équivalents aglycones/g de tissu selon le polyphénol considéré, la dose administrée et le tissu analysé (241).

Les principales voies d’excrétion des flavonoïdes sont les voies biliaires et urinaires. Le choix de la voie d’excrétion dépend de la structure chimique des molécules. Ainsi, les métabolites hautement conjugués seront principalement éliminés dans la bile tandis que les petits conjugués comme les monosulfatés seront préférentiellement éliminés par voie urinaire (302). Les métabolites excrétés dans la bile pourront être réabsorbés au niveau de la muqueuse colique permettant ainsi la formation d’un cycle entérohépatique (241). L’excrétion urinaire des flavonoïdes varie d’une molécule à l’autre et peut aller de 0,3 à 43 % de la dose ingérée (pour 50 mg d’aglycone). Ce type d’excrétion est faible pour les anthocyanes, les flavan-3-ols et les flavonols. Toutefois, l’excrétion urinaire des acides phénoliques et des isoflavones est très élevée (303).