Status alternatieve tests voor toxicologisch onderzoek



Acute toxicity (oral, dermal, inhalation): LD₅₀ tests

Still in vivo tests needed but death is not the endpoint

Validated in vivo tests which reduce and refine animal testing

TG 420, 425, 433, 434 (proposal), 436 Normal human keratinocyte

neutral red uptake assay GD 129 (2010) Balb/c 3T3 neutral red uptake GD 129 (2010)

100

Acute (OECD TG 401) and subacute (OECD TG 407) toxicity tests Alternative tests for acute and subacute toxicity

12 8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM



Skin corrosion and irritation

In vivo Draize skin test (OECD TG 404) not allowed anymore Alternative skin corrosion tests

Alternative skin irritation tests In vitro membrane barrier test method for skin

corrosion (Corrositex®) TG 435 (2015)

In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method (Episkin®, EpiDerm^TM ,

SkinEthic^TM RHE and epiCS®)

TG 431 (2016) In vitro skin corrosion: Transcutaneous Electrical

Resistance test method (TER) TG 430 (2015)

3. Status alternatieve tests voor toxicologisch onderzoek

Reconstructed human epidermis test method (EpiSkin® (SM), EpiDerm^TM SIT (EPI-200), SkinEthic^TM RHE, LabCyte EPI-MODEL24SIT)

TG 439 (2015)

13 8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM



Eye irritation

In vivo Draize eye test (OECD TG 405) allowed only after 1) physico-chemical parameters have been analysed and 2) in vitro testing has been done and no classification can be made for mild or moderate irritation. In vivo testing taking into consideration reduction (less animals) and refinement (anesthesia, …).

Alternative eye irritation tests

Fluorescein Leakage (FL) test TG 460 (2012)

CIRC cells Bovine corneal opacity permeability (BCOP) test TG 437 (2013)

Isolated chicken eye (ICE) test TG 438 (2013)

Short time in vitro test method for identifying i) chemicals inducing serious eye damage and ii) chemicals not requiring classsification for eye irritation or serious eye damage

TG 491 (2015) Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE)

test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage

TG 492 (2015)

3. Status alternatieve tests voor toxicologisch onderzoek

14 8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM

3. Status alternatieve tests voor toxicologisch onderzoek



Skin sensitization

Local lymph Node assay (LLNA): reduction and refinement test

OECD TG 429, 442A Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) TG 442C (2015) ARE-Nrf2 Luciferase Test Method (KeratinoSens^TM) TG 442D (2015) Human Cell Line Activation Test (h-CLAT) TG 442E (2016) U937 cell line activation test (U-SENS^TM) Draft TG

IL-8 Luc assay Draft TG

X

In vivo Guinea Pig Maximization Test of Magnusson and Klingman and Buehler Test (OECD TG 406)

Alternative skin sensitization tests

X

3T3 Neutral Red Uptake Phototoxicity test TG 432 (2004) ROS (Reactive Oxygen Species) assay Draft TG



Phototoxicity

Alternative phototoxicity tests

15

3. Status alternatieve tests voor toxicologisch onderzoek



Genotoxicity

In vivo Chromosome Aberration Test (OECD TG 475; 2014), Micronucleus Test (OECD TG 474; 2016), UDS Test (OECD TG 486; 1997), Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays (OECD TG 488; 2013), Comet Test (OECD TG 489, 2014)

Alternative genotoxicity tests

Bacterial reverse mutation test TG 471 (1997) Mammalian cell gene mutation tests using the Hprt TG 476 (2015) and xprt genes

Mammalian cell gene mutation tests using the TG 490 (2016) thymidine kinase gene

In vitro chromosome aberration test TG 473 (2016) In vitro mammalian cell micronucleus test TG 487 (2016) In vitro sister chromatid exchange test TG 479 (1986) In vitro unscheduled DNA synthesis test TG 482 (1986) Saccharomyces cerevisiae gene mutation test TG 480 (1986) Saccharomyces cerevisiae mitotic recombination test TG 481 (1986)

8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM

16 8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM

3. Status alternatieve tests voor toxicologisch onderzoek



Subchronic and chronic toxicity

No GD or TG Alternative subchronic and chronic toxicity tests

Subchronic Toxicity Test in rodents (OECD TG 408) and non-rodents (OECD TG 409), Chronic Toxicity Test in rodents (OECD TG 452)



Reproductive & developmental toxicity

No GD or TG

Prenatal Development Toxicity Study (OECD TG 414), One-generation Repro- ductive Toxicity Test (OECD TG 415), Two-generation Reproductive Toxicity Study (OECD TG 416), Developmental Neurotoxicity Study (OECD TG 426) Alternative reproduction toxicity tests



Carcinogenicity

Alternatives to the 2-year bioassay: in vivo tests with transgenic animals, neonatal mice and initiation- promotion models

No GD or TG Syrian Hamster Embryo (SHE) cell transformation

assay (CTA) GD (2015)

Carcinogenicity study in rats and mice (OECD TG 451) Alternative carcinogenicity tests

17

Inhoud

1. Historiek van de 3 V’s of 3R’s en wetgeving

2. Gegevens naar proefdiergebruik voor toxicologisch onderzoek

3. Status alternatieve tests voor toxicologisch onderzoek 4. Perspectieven

5. Hinderpalen 6. Besluit

8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM 18

4. Perspectieven

Nieuwe benadering voor het ontwikkelen van alternatieve tests: IATAs Integrated Approach to Testing and Assessment (IATAs) based on the

Adverse Outcome Pathway (AOP) concept

8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM

19

4. Perspectieven

Voorbeeld van een IATA: mechanismen voor huidsensibilisering

1^st exposure INDUCTION ELICITATION

to chemical

(hapten) _Dermal

Chemical penetration

properties Interaction with proteins

Molecular Interaction

initiating ^{with DC}

events ₂nd exposure

to chemical

Cellular DC activation (hapten)

response

Organ response Organism response

8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM

AOPs en beschikbare alternatieve tests voor huidsensibilisering

DPRA (P&G)

NCTS 2544 IL-18 (Univ. Milan) proliferation assay (Univ. Lyon & Univ

Reisinger and Hoffman et al.

Toxicology in Vitro 29 (2015) 259-270

20 8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM

4. Perspectieven

Voorbeeld van een IATA: mechanismen voor huidsensibilisering

21

4. Perspectieven

EU Framework programs

EU-TOXRisk: an Integrated European ‘Flagship’ Programme Driving Mechanism-based Toxicity and Risk Assessment for the 21^st century

• Doel: het stimuleren van een paradigma wijziging in toxicologie naar

proefdiervrije, op mechanismen gebaseerde risicobeoordeling bij middel van een aantal “cases”. Dit zou moeten resulteren in de ontwikkeling van proefdiervrije teststrategieën voor het testen van chemicaliën.

• 8 cases opgenomen die relevant zijn voor risicobeoordeling door de regelgevers (project positief ontvangen door de regelgevers).

• Focus naar 2 toxicologische areas: 1) systemische toxiciteit bij herhaalde dosering (long, nier, lever en zenuwstelsel) en 2) voortplantings- en ontwikkelings

toxicologie.

• Integratie van betere kennis in cel- en systeembiologie, omics technieken en computermodellen om de complexe keten aan biologische mechanismen te kunnen koppelen aan toxicologische bevindingen.

• Samenwerking met de US Tox21 partners.

• Budget: 30 miljoen € (project van 6 jaar met start op 1 Januari 2016)

8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM

4. Perspectieven

Nederlands project: “Transitie naar proefdiervrij onderzoek – over mogelijkheden voor het uitfaseren van dierproeven en het stimuleren van proefdiervrije innovatie”

Opgezet door het Nationaal Comité advies proefdierenbeleid (NCad) in opdracht van de Nederlandse Staatsecretaris van Economische zaken

“Legally prescribed animal testing for safety research on chemical substances, food ingredients, pesticides and medicines (including

veterinary medicines) can be phased out by 2025”

(quote Herman Koëter, Chairman of NCad)

3D-huidmodel voor micronucleus test

• Belangrijk voor de cosmetische industrie

• Validatierapport binnenkort beschikbaar

Mutation Research 607 (2006) 192–204 8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM 22

23

Inhoud

1. Historiek van de 3 V’s of 3R’s en wetgeving

2. Gegevens naar proefdiergebruik voor toxicologisch onderzoek

3. Status alternatieve tests voor toxicologisch onderzoek 4. Perspectieven

5. Hinderpalen 6. Besluit

8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM

Spielmann (1966)

MAS

Laboratorium

Vastzitten aan het paradigma dat het proefdier de “gouden standaard” is

• Het dierenmodel niet langer als de “gouden standaard” aanzien.

In Vivo Draize test (OECD TG 405; 2002)

Irritant Niet-irritant

• Kunnen afscheid nemen van bestaande denkwijzen en praktijken. Het denken vanuit bestaande patronen leidt niet tot snelle ontwikkeling van alternatieve modellen. Er is een radicale omslag nodig in de manier van denken, doen en organiseren.

• Dierproeven zijn vastgelegd in vele richtlijnen en wetten. Om tot een herziening van het paradigma en een reductie in het proefdiergebruik voor wettelijk verplichte veiligheidstesten te kunnen komen moeten we de regelgevers mee hebben.

24 8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM

5. Hinderpalen

25

5. Hinderpalen

Er wordt niet genoeg ingezet op dierproefvrije innovaties

• Er moet meer focus zijn naar het ontwikkelen van proefdiervrije innovaties.

• Beschikbaarheid fondsen voor het ontwikkelen van proefdiervrije innovaties is relatief beperkt.

• We merken dat door niet doorgedreven onderzoek veel proefdiervrije innovaties nog altijd moeizaam de weg van ontwikkeling naar toepassing doorlopen.

• Initiatieven en fondsen zijn versnipperd. De EU Framework Programs zijn al een stap in de goede richting maar ze moeten meer gefocusseerd worden naar het ontwikkelen van testen die tot regelgeving kunnen komen.

• Overheid zou meer moeten faciliteren in het ontwikkelen van proefdiervrije innovaties.

8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM 26

5. Hinderpalen

De complexiteit van de biologische systemen bij zoogdieren zorgt ervoor dat men een batterij aan in vitro alternatieve tests nodig heeft om gans het biologisch proces te kunnen omvatten

ReProTect: Europees programma met doel het ontwikkelen van tests voor voortplanting- en ontwikkelingstoxicologie

2-Generation reproductive tox

Developmental tox

Geschatte proefdierverbruik door REACH 8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM

27 8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM

5. Hinderpalen

Hoge kost en lange tijdsduur voor validatie van alternatieve modellen

• Investeren in de validatie van proefdiervrije modellen is wetenschappelijk gezien niet “sexy” en kan je moeilijk publiceren.

• Zowel de Europese als Nationale overheden zouden de validatie van proefdier- vrije methoden meer moeten stimuleren en financieel ondersteunen.

EURL-ECVAM kan het financieel niet alleen aan en moet in haar taak zowel financieel als met menselijke resources meer ondersteund worden door de Nationale overheden.

• Door de hoge kost en tijdsduur van validatie, evolueren sommige proefdiervrije innovaties niet naar toepassing.

• De validatie duurt zeer lang. Er is nood aan versnelde en kortere validatie procedures.

Regulatory Academia Industry

Post-

review comment Peer

ment “valid test” validation review

models Catch-up validation Me-too Test Presubmission Form Test Submission Template

EURL-ECVAM “VAMs”

Industrial and regulatory driven process

Retro-

Er is niet genoeg kennis beschikbaar over proefdiervrije innovatie en de 3V’s

• Er moet meer multidisciplinair en grensoverschrijdend samengewerkt worden en er moet beter gecommuniceerd worden.

EURL-ECVAM heeft dit ingezien. Op 28-29 November 2017 grijpt er een “Joint PARERE ESTAF Workshop “Better knowlege sharing for advancing alternative approaches” plaats te Ispra (I) om 1) bestaande kennisbronnen aangaande 3V’s beter te coördineren, verspreiden en communiceren, en 2) opleidingen en trainingen te verbeteren.

• In het bijzonder moet er meer focus komen naar blootstelling, kennis van kinetiek en moleculaire biologie om werkingsmechanismen te ontrafelen en zo doelgericht proefdiergebruik af te bouwen. Hoe relevant zijn de diermodellen om veiligheid van de mens te voorspellen?

• De kennis en data die er is zit Nationaal en Europees verdeeld over verschillende databasen. Een meer gecentraliseerde database zou het de onderzoekers gemakkelijker maken om een zoektocht te ondernemen om te weten of er voor de in vivo test die ze willen uitvoeren er überhaupt al een alternatieve test bestaat.

8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM

29

5. Hinderpalen

Het mondiale speelveld van zowel de regelgeving voor o.a. chemicaliën (Europese Commissie, …) en geneesmiddelen (EMA, FDA, …) als het opstellen van nieuwe testrichtlijnen (OECD, ECHA), vertraagt sterk het opnemen van alternatieve tests ter vervanging van de conventionele proefdiertests

Voorbeelden:

• De vervanging van de LD₅₀ naar andere dierexperimentele ontwikkelingen heeft 30 jaar geduurd.

• Soms komen tests niet tot een EU of OECD richtlijn (vb. prevalidatie van de in vitro celtransformatietest met Syrische hamster embryo (CTA SHE) cellen).

Syrische

Carcinogeen Hamster

Embryo [Benzo(a)pyrene]

(SHE) cellen

Niet getransformeerde kolonie Getransformeerde kolonie 1) Sensitiviteit van de CTA voor: - genotoxische carcinogenen: 82%

- niet-gentoxische carcinogenen: 58%

(ref. OECD Draft guidance document: in vitro syrian hamster embryo (SHE cell transformation assay (July 2014). Paris, France) 2) Goede resultaten in de prevalidatiestudie

 Geen OECD “Technical Guideline” maar een “Guidance Document”

8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM 30

5. Hinderpalen

Ontwikkeling van in vitro alternatieve tests wordt nog teveel gedaan op onderzoeksmodellen van een andere organisme

• Ontwikkeling zou meer moeten gedaan worden op cellijnen, primaire cellen en systemen gebaseerd op humaan materiaal (vb. human on a chip).

• Er wordt nog teveel gevalideerd naar dierlijke modellen. Er zouden meer humane data moeten beschikbaar gemaakt worden zodat de nieuw ontwikkelde alternatieven naar humane data kunnen gevalideerd worden.

• Humaan weefsel is moeilijk te krijgen. Dit zou eenvoudiger en sneller moeten kunnen verkregen worden.

• Als toch nog een proefdiermodel nodig is, zouden in vitro (of ex vivo) kinetiekstudies moeten uitmaken welk het meest relevante diermodel is naar de mens toe waarbij dan dus voor ontwikkeling van een product maar één diersoort wordt gebruikt in plaats van standaard 2 diersoorten.

8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM

31

Inhoud

1. Historiek van de 3 V’s of 3R’s en wetgeving

2. Gegevens naar proefdiergebruik voor toxicologisch onderzoek

3. Status alternatieve tests voor toxicologisch onderzoek 4. Perspectieven

5. Hinderpalen 6. Besluit

8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM 32

6. Besluit

• Status van alternatieve tests _ Phototoxiciteit voor proefdiertests:

 Percutane absorptie

 Huidcorrosie

 Genotoxiciteit

 Huidirritatie

 Oogirritatie

 Huidsensibilisatie

 Acute toxiciteit

 Subchronische & chronische toxiciteit

 Photosensibilisatie

 Toxicokinetiek

 Voortplanting- en ontwikkelingstoxicologie

 Carcinogenese

• Er moet zeker en vast nog meer focus gelegd worden naar het ontwikkelen van in vitro alternatieven tests met cellen en weefsels van de mens en de validatie van deze alternatieve tests moet sneller en goedkoper kunnen.

• Om meer vooruitgang te kunnen boeken hebben we een radicale omslag nodig in ons denken waarbij we het paradigma, dat het proefdier de “gouden standaard” is, van ons moeten afzetten.

8/11/2017 - Studiedag Dierenwelzijn - Leefmilieu Brussel - BIM

4^de R (Responsibility) of

4^de V (Verantwoordelijkheid)

Dank voor Uw aandacht.

Vragen?

Philippe Vanparys, PhD, ERT

Guest Professor KU Leuven, Technology campus De Nayer Consultant Genetic Toxicology

Dans le document Journée d'étude sur le bien-être animal en Région de Bruxelles-Capitale : "Animaux de labo, où en est-on ?" (Page 25-36)