Statistiques

Le logiciel Prism nous permet de générer des graphiques et d’établir des statistiques détaillées en fonction des différentes expérimentations. Les résultats sont moyennés et exprimés avec l’erreur standard à la moyenne (SEM : Standard Error of the Mean).

Pour l’étude du marquage de la périphérie des cellules après un contact avec les toxines (voir Chapitre IV), un test d’analyse de la variance ANOVA one-way a été effectué, suivi par un test de comparaison multiple de Tukey. Concernant les autres résultats, un test ANOVA two-way a été effectué, suivi par un test de Bonferroni, comparant les conditions par rapport au témoin des cellules seules.

Ceci nous permet d’obtenir des résultats significatifs en nous basant sur cette échelle :

Valeur de p Symbole Pourcentage

p < 0, 0001

****

0,0001 < p < 0,001

***

**

0,01 < p < 0,05

*

Chapitre III

Cibles cellulaires de la

LPV et de HlgC/HlgB

1 INTRODUCTION

Bras armé du système immunitaire, les leucocytes ont un rôle essentiel dans la défense de l’hôte contre les pathogènes. Ils sont de deux sortes : soit issus de la lignée myéloïde, soit de la lignée lymphoïde. Le progéniteur myéloïde est à l’origine des cellules non-leucocytaires que sont les érythrocytes et les plaquettes, mais également des granulocytes (neutrophiles, éosinophiles, basophiles), des monocytes, des macrophages et des cellules dendritiques. Le progéniteur lymphoïde, quant à lui, se différencie en cellules NK (Natural Killer) et en lymphocytes T ou B.

Il a été montré que la Leucocidine de Panton et Valentine (LPV) cible les cellules dès le stade des myélocytes (qui se différencient ensuite en neutrophiles, monocytes, macrophages…), tandis que HlgC/HlgB a un effet sur l’ensemble de la lignée myéloïde (Gauduchon et al., 2001; Meunier et al., 1995; Szmigielski et al., 1998). De plus, les deux leucotoxines n’ont pas d’affinité pour la lignée lymphoïde en raison de l’absence du récepteur au composé S. En effet, le C5aR, récepteur majoritaire de LukS-PV, et également de HlgC, n’est pas présent sur les lymphocytes.

Historiquement, au laboratoire, le modèle d’étude privilégié est le polynucléaire neutrophile humain (PNN), qui est le premier type cellulaire à être attiré au site d’infection et à rencontrer le pathogène. C’est ainsi que Gauduchon et al. (2001) a déterminé une forte affinité de fixation de LukS-PV sur les PNN (Kd = 0,07 nM) et sur les monocytes (Kd = 0,02 nM). Cependant, il apparaît que le neutrophile est un modèle d’étude délicat à utiliser.

En effet, le PNN a une durée de vie de 12 à 24h dans la circulation sanguine, ce qui rend de nombreux tests difficiles à mettre en œuvre, comme la transfection. De plus, le neutrophile est le premier élément du système immunitaire à entrer en contact avec le pathogène, permettant ainsi l’activation et l’attraction des autres cellules de l’immunité. De ce fait, il est facilement stimulable par tout élément étranger à l’organisme, et le fait de manipuler le sang, de lui faire subir des variations de température, puis d’isoler les neutrophiles, entraînent souvent une sensibilisation exacerbée des cellules. Au laboratoire, de nombreuses préparations de PNN n’ont ainsi pas pu être utilisées pour les analyses en raison d’une mort prématurée des cellules. Également, au cours des derniers mois, nous avons pu mettre en évidence un lien entre l’âge des patients et l’état physiologique des cellules après isolement. Il semblerait que les cellules des donneurs ayant plus d’une cinquantaine d’années ne puissent pas toujours être utilisées en raison d’une mort précoce des neutrophiles. Cette différence entre les neutrophiles des donneurs « jeunes » et « âgés » pourrait être expliquée par le fait que les donneurs au-dessus de cinquante ans

Pour ces raisons, il est nécessaire d’avoir un autre modèle cellulaire que le neutrophile, d’une part pour s’affranchir de la fragilité et de la sensibilité exacerbée des neutrophiles, mais également pour des études plus longues que 24h. Ainsi, la lignée lymphoïde U937 transfectée avec le C5aR a été utilisée, et la mise en place d’un protocole de différenciation des monocytes a permis l’obtention et la culture de macrophages humains.

2 NEUTROPHILES HUMAINS

Le laboratoire utilise les PNN comme modèle d’étude depuis de nombreuses années et son interaction avec la LPV est plutôt bien caractérisée. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à savoir si les bouleversements morphologiques lors d’une mise en contact avec la LPV pouvaient être visibles au microscope à contraste de phase en vidéomicroscopie. Ainsi, les PNN ont été mis en contact pendant 20 min avec 2 nM de LPV dans du tampon EGTA supplémenté de 1 mM de calcium (Figure III.1). Au temps 0 (A), la cellule (flèche noire) est étalée sur le fond de la boîte, mais après quelques minutes, elle commence à se rassembler sur elle-même. Dès 10 min (B), le noyau est bien visible car il se condense et s’arrondit. Enfin, à 20 min (C), le contenu de la cellule commence à être relargué vers l’extérieur, montrant ainsi une lyse cellulaire.

Figure III.1 – Observation au microscope à contraste de phase des neutrophiles en contact avec 2 nM de LPV

Au début de l’incubation avec 2 nM de LPV dans du tampon EGTA supplémenté de 1 mM de calcium, les cellules adhèrent sur le fond de la boîte (A). Ce n’est qu’à 10 min (B) que la cellule (flèche noire) commence à s’arrondir et le noyau à se rassembler sur lui-même pour perdre sa structure polylobée. À 20 min (C), la cellule commence a relarguer son contenu cellulaire.

Ces résultats permettent donc de mettre en évidence l’effet létal de la LPV au niveau de la morphologie des PNN. Afin de poursuivre cette étude de l’interaction PNN/LPV, l’immunocytochimie a été utilisée pour visualiser directement la toxine fixée à la surface de la cellule (Figure III.2). Nous pouvons ainsi voir que la LPV est présente à la surface de la cellule. De plus, la concentration de 0,25 nM permet d’avoir un signal suffisant et non saturant, mais ne semble pas altérer les noyaux.

Figure III.2 – Observation au microscope confocal du marquage de la LPV sur neutrophiles humains

Le marquage rouge correspond à la sous-unité S de la LPV 0,25 nM pendant 10 min. Le bleu représente le marquage au Hoescht des noyaux.

La LPV se fixe donc à la surface du neutrophile avec une affinité que nous avons déterminé. Les constantes de dissociation des deux leucotoxines d’intérêt ont été obtenues en mettant les cellules en contact avec LukS*-PV/LukF-PV ou HlgC/HlgB* (Figure III.3). La régression non linéaire permet le calcul du Kd qui est de 0,17 nM pour la LPV (A) et 0,87 nM pour HlgC/HlgB (B). L’Hémolysine γ a ainsi une affinité légèrement inférieure à celle de la LPV.

Figure III.3 – Détermination du Kd de la LPV et de HlgC/HlgB sur neutrophiles humains

La constante de dissociation est faible pour la LPV (A) et légèrement plus élevée pour HlgC/HlB (B) (n=3).

Enfin, notre étude du modèle neutrophile humain s’est également intéressée aux conséquences de la LPV sur les cellules. Il est connu que les leucotoxines entraînent la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-8, et c’est ce que nous avons cherché à démontrer (Figure III.4). Ainsi, la

Figure III.4 – Quantification de l’IL-8 sur les neutrophiles humains en contact avec la LPV et HlgC/HlgB

Il y a une sécrétion d’IL-8 avec 1 nM de LPV (A) à partir de 3h. Concernant HlgC/HlgB (B), il y a une forte production de la cytokine à 6h pour 0,5 et 1 nM. (n=1)

Les résultats obtenus précédemment au laboratoire, sur la sécrétion d’IL-8 lors d’un contact avec la LPV (König et al., 1994), suggèrent un effet plus important de la toxine sur les neutrophiles que dans notre étude. En effet, pour une concentration d’environ 0,2 nM, au même temps d’incubation, la sécrétion d’IL-8 est multipliée 5 à 6 fois par rapport à nos résultats. Il faudra refaire cette expérience afin d’avoir des résultats statistiques pour comparer l’effet de la LPV. Cependant, HlgC/HlgB semble entraîner une sécrétion d’IL-8 bien supérieure au bruit de fond.

3 U937-C5aR

Les cellules U937-C5aR sont issues d’une lignée lymphoïde dépourvue de C5aR, mais transfectée par la suite avec ce récepteur. Nous avons testé sa sensibilité à la LPV et à HlgC/HlgB. En premier lieu, les changements morphologiques des U937-C5aR, en contact avec 2 nM de LPV dans du tampon EGTA supplémenté de calcium, semblent plus minimes que sur les PNN (Figure III.5). En effet, nous pouvons voir qu’à partir de 10 min (B, flèche noire), la surface de la membrane subit des altérations par rapport au temps 0 (A), mais la lyse à proprement parler n’est pas visible sur la vidéo, même à 20 min (C).

Figure III.5 – Observation au microscope à contraste de phase des cellules U937-C5aR en contact avec 2 nM de LPV

Au début de l’incubation avec 2 nM de LPV dans du tampon EGTA supplémenté de 1 mM de calcium, les cellules adhèrent sur le fond de la boîte (A). Ce n’est qu’à 10 min (B) que la cellule (flèche noire) commence à s’arrondir légèrement et où les changements à la surface s’opèrent pour augmenter en intensité à 20 min (C).

Comme les U937-C5aR semblent se montrer moins sensibles que les PNN, la question de savoir si la toxine se fixe de la même manière se pose. Dans cette étude en immunofluorescence (Figure III.6), c’est seulement à partir d’une concentration de 2 nM de LPV que le marquage de la toxine commence à être bien visible à la surface de la cellule, soit une concentration dix fois supérieure à celle sur PNN.

Figure III.6 – Observation au microscope confocal du marquage de la LPV sur U937-C5aR

Le marquage rouge correspond à la sous-unité S de la LPV 2 nM pendant 10 min. Le bleu représente le marquage au Hoescht des noyaux.

Afin d’étudier la fixation des deux toxines de manière plus quantitative, les cellules U937-C5aR ont été mises en contact avec des concentrations croissantes de LPV et de HlgC/HlgB (Figure III.7). Ainsi, le Kd pour la LPV est de 0,29 nM (A) et celui pour HlgC/HlgB est plus important à 2,16 nM (B). De ce fait, la différence entre les deux toxines est plus importante que pour les PNN.

Figure III.7 – Détermination du Kd de la LPV et de HlgC/HlgB sur U937-C5aR

La constante de dissociation est faible pour la LPV (A) et beaucoup plus élevée pour HlgC/HlB (B) (n=3).

4 MACROPHAGES DERIVES DE MONOCYTES

Alors que la lignée U937-C5aR semble être moins sensible à la LPV et à HlgC/HlgB que les PNN, et que les neutrophiles humains ont une durée de vie très courte, la détermination d’un nouveau modèle d’étude est nécessaire. Nous nous sommes ainsi intéressés aux macrophages humains. Dérivés des monocytes – qui ont une affinité de fixation pour LukS-PV encore meilleure que les PNN –, ils ont l’avantage d’être aisément différenciables grâce à l’hormone GM-CSF et peuvent se maintenir jusqu’à 3 semaines. Les expérimentations sont réalisées en présence de milieu RPMI supplémenté de 10 % de sérum de veau fœtal ou de sérum humain. Le milieu RPMI contient une concentration en calcium de 0,4 mM.

Les premiers tests effectués sur ces cellules ont porté sur l’étude morphologique, afin de savoir si la toxine entraînait également des bouleversements visibles. Ainsi, la LPV à 2 nM est mise en contact avec les macrophages dans du milieu RPMI/10% sérum humain pendant 30 min (Figure III.8). La vidéo montre dès 15 min l’altération de la cellule (B, flèche noire du haut) par rapport au temps 0 (A), celle-ci devient plus sombre et le nucléole commence à apparaître (flèche orange). Enfin, à 30 min (C), les macrophages commencent à être lysés (flèche noire du bas) et le contenu cellulaire est relargué vers l’extérieur (flèche bleue).

Figure III.8 – Observation au microscope à contraste de phase des macrophages en contact avec 2 nM de LPV

Les macrophages sont mis en contact avec la LPV dans du milieu RPMI supplémenté de sérum humain (A). À 15 min (B), la flèche noire montre l’arrondissement et le grossissement de la cellule. Il ne faut pas plus de quelques minutes pour que des changements morphologiques s’opèrent et rendent visible le nucléole (point noir dans le noyau, flèche orange). Enfin, à 30 min (C), le nucléole est encore plus visible et les cellules commencent à être lysées (flèche bleue).

Comme les macrophages sont plus grands que les neutrophiles (20-60 µm contre 10-14 µm), il est plus aisé d’observer les modifications cellulaires causées par la LPV. Toutefois, la visualisation de la LPV au microscope confocal pose plus de problèmes que sur les PNN (Figure III.9). En effet, il faut 2 nM pour que le signal soit bien visible. De plus, la toxine semble se concentrer majoritairement à la périphérie, alors que pour les PNN ou les U937-C5aR, plusieurs spots de fluorescence étaient visibles à l’intérieur de la cellule également.

Figure III.9 – Observation au microscope confocal du marquage de la LPV sur macrophages humains

Le marquage rouge correspond à la sous-unité S de la LPV 2 nM pendant 10 min dans du RPMI/SVF. Le Hoescht marque les noyaux en bleu, mais ici, sur les macrophages, il n’est pas visible avec le protocole utilisé.

Afin d’étudier plus en avant cette fixation des leucotoxines sur les macrophages, la détermination du Kd

est effectuée en présence de LPV et de HlgC/HlgB dans le milieu RPMI/10 % SVF (Figure III.10). Le Kd pour la LPV est de 0,30 nM (A) et celui de HlgC/HlgB montre, dans des résultats préliminaires, une

Figure III.10 – Détermination du Kd de la LPV et de HlgC/HlgB sur macrophages humains

La constante de dissociation est faible pour la LPV (A, n=3) et augmente de beaucoup pour Hlgc/Hlb (B, n=1).