Signalisation intracellulaire

La LPV semble donc induire de la NETose avec une activation de la NADPH oxydase et de l’autophagie. À l’inverse, HlgC/HlgB entraîne seulement une activation de l’autophagie à des doses faibles. Cependant, les toxines n’ont pas seulement un effet sur la mort cellulaire ou l’autophagie, mais plus généralement, elles peuvent induire d’autres bouleversements dans la cellule.

5 SIGNALISATION INTRACELLULAIRE

Un premier essai de caractérisation des voies de signalisation intracellulaires dans les neutrophiles a été effectué. L’idée était de cibler des molécules clés de certaines voies comme la PI3K ou ERK afin d’étudier leur présence par Western Blot. Cependant, les résultats préliminaires avec ERK ne sont pas exploitables, contrairement à ceux avec la PI3K (Figure V.10). La phosphorylation de la sous-unité p85α de la PI3K est visible par une bande à 85 kDa, que nous retrouvons après un contact des neutrophiles avec 0,25 et 1 nM de LPV, ainsi qu’avec HlgC/HlgB à 1 nM. Le contrôle avec le PMA montre également cette bande mais l’intensité est plus faible. Enfin, la bande correspondant à p85α en présence de 1 nM de LPV est très intense par rapport aux autres.

La bande à 85 kDa est présente après un contact avec la LPV à 1 nM où elle est très intense. Une concentration plus faible de 0,25 nM montre une intensité plus faible, tout comme pour HlgC/HlgB 1 nM ou le contrôle PMA (n=1).

6 DISCUSSION

6.1 CONCLUSION

Dans des conditions physiologiques de culture et à 6h d’incubation avec la LPV, l’apoptose est effectivement observée à des concentrations de 0,25 nM et 1 nM, ainsi qu’une perméabilisation des membranes des neutrophiles dès 0,25 nM. Ces résultats appuient les conclusions de Genestier et al. (2005) sur l’apoptose déclenchée par des concentrations faibles de LPV. Cependant, la perméabilisation des membranes que cette équipe associe à de la nécrose est effective à faible concentration, alors qu’ils démontraient que cela ne concernait que les fortes concentrations comme 5 nM. De plus, cette perte d’intégrité des membranes ne semble pas forcément associée au phénomène de nécrose, mais plus sûrement à de la NETose. En effet, la NETose intervient dans les mêmes temps d’incubation, pour les mêmes concentrations de LPV et concernent le même pourcentage de cellules que pour les cellules perméables à l’iodure de propidium. Les neutrophiles en contact avec la LPV entreraient donc précocement en apoptose pour une part, ou en NETose pour une autre partie de la population cellulaire. Enfin, HlgC/HlgB n’entraîne aucune conséquence pour le neutrophile, que ce soit au niveau d’une perméabilisation de la membrane plasmique, de l’apoptose ou encore de la NETose. Cependant, HlgC/HlgB est impliqué dans une activation de l’autophagie à faible concentration (0,1 nM), tout comme la LPV à 0,25 nM.

L’absence d’activation de la caspase 8 suggérerait que la voie extrinsèque n’est pas celle utilisée par la LPV pour déclencher l’apoptose. De plus, la présence de la forme active de la caspase 9 dans toutes les conditions serait due au fait que le neutrophile est une cellule qui entre naturellement en apoptose à la fin de sa vie, et cette apoptose s’opère via à la voie intrinsèque qui dépend des mitochondries. Il s’agit de résultats préliminaires et les expériences sont à poursuivre, afin de confirmer ou non l’hypothèse de Genestier et al. (2005) sur l’activation de la voie intrinsèque lors d’un contact des cellules avec la LPV. La différence de résultats entre le test TUNEL et celui de l’Annexine V montre effectivement que la méthode TUNEL est plus performante et plus sensible pour quantifier l’apoptose. En effet, pour le témoin de l’apoptose, la puromycine, le TUNEL permet d’observer un pourcentage de cellules positives au marquage de plus de 10 % supérieur à celui retrouvé avec l’Annexine V. De plus, les résultats d’un donneur à l’autre sont plus reproductibles avec la méthode TUNEL. L’Annexine V permet d’étudier les changements membranaires tandis que la méthode TUNEL permet l’observation de la fragmentation de l’ADN. Cette dernière est très reproductible et l’erreur à la moyenne est relativement faible, ce qui n’était pas le cas avec l’Annexine V. De plus, il est à noter une grande variabilité dans les résultats lors de la détermination de l’apoptose avec l’Annexine V, de la NETose ou encore de l’autophagie. En effet, entre

4 à 8 expériences ont été nécessaires dans ces cas-là afin d’obtenir des contrôles représentatifs et des résultats significatifs. Cette variation entre les expériences pourrait être causée par le type d’analyse et la méthode utilisée, mais également par la différence entre les populations de neutrophiles. Effectivement, une population de neutrophiles donnée n’est pas stimulable de manière homogène et toutes les cellules ne répondent pas de la même manière. De plus, il existe une différence entre les donneurs, ce qui entraîne également une certaine hétérogénéité dans la réponse des neutrophiles. C’est ainsi que l’utilisation d’un autre modèle cellulaire, dont la population réagira homogènement face à une stimulation donnée, permettra de remédier à ce problème. L’emploi de macrophages, par exemple, semble une bonne alternative aux neutrophiles.

6.2 PERSPECTIVES

L’autophagie et l’activation de la NADPH oxydase NOX2 sont deux éléments qui semblent requis pour le processus de NETose lors d’un contact avec la LPV, tout comme avec le PMA. Cependant, l’implication de ces deux mécanismes nécessite une étude plus approfondie, avec d’autres inhibiteurs de NOX2, par exemple, ou même de l’autophagie. La transfection est également un bon outil qui permettrait d’inhiber complètement l’autophagie (protéine LC3) ou la NADPH oxydase (sous-unité de NOX2), afin d’étudier au mieux l’effet sur la NETose (Dickinson et al., 2011; Mohan et al., 2013). Également, ce chapitre aborde très rapidement la recherche des voies de signalisation activées lors d’un contact avec la LPV ou HlgC/HlgB. Toutefois, cette question est particulièrement importante pour mieux comprendre le mécanisme d’action de ces toxines et trouver une stratégie de lutte ciblée. Ainsi, la première étape sera de se concentrer sur des molécules clés de certaines voies de signalisation afin de les inhiber. Nous pourrons ainsi étudier plus en avant la PI3K, ERK ou encore les protéines G comme RhoA, Rac2 ou Cdc42 qui sont impliquées dans le remodelage de l’actine, l’adhésion ou encore la formation de la NADPH oxydase.