Stabilité des complexes d’Au(I) mono-(NHC) thiolate [MAuSMan] sous irradiation lumineuse

L’efficacité d’un PS est fortement dépendante de sa photostabilité, plus vite il est dégradé et moins il sera efficace. C’est pourquoi la photostabilité des complexes [NiAuSMan] et [FbAuSMan] a été évaluée par comparaison des spectres RMN 1H de ces complexes avant et après 72 heures d’irradiation à la lumière ambiante. Contrairement aux porphyrines bases libres, les porphyrines de Ni(II) sont incapables de générer de l’1O2 sous irradiation. Le complexe [NiAuSMan] sert donc de contrôle pour mettre en évidence un potentiel mécanisme de photodégradation faisant intervenir l’1O2. Ces expériences ont été directement menées dans des tubes RMN en utilisant le CD2Cl2 comme solvant.

Stabilité du complexe [NiAuSMan]

Les spectres RMN 1H à t = 0 et t = 72 heures issues de l’expérience d’irradiation de [NiAuCl] sont visibles dans la Figure 3.17. Il apparaît de façon nette que les spectres RMN 1H à t = 0 et t = 72 heures sont quasiment identiques. De plus, aucun précipité n’est apparu après irradiation, ce qui confirme la photostabilité de [NiAuSMan].

298 K 318 K 338 K 358 K 378 K Retour 298 K [ppm]

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Figure 3. 17 Superposition des spectres RMN 1H de [NiAuSMan] à t = 0 (rouge) et t = 72 heures (bleu) dans le CD2Cl2 à 298 K (300 MHz).

Stabilité du complexe [FbAuSMan]

Les spectres RMN 1H à t = 0 et t = 72 heures issus de l’expérience d’irradiation de [FbAuSMan] sont visibles dans la Figure 3.18.

Figure 3. 18 Superposition des spectres RMN 1H de [FbAuSMan] à t = 0 (rouge) et t = 72 heures (bleu) dans le CD2Cl2 à 298 K (300 MHz). t = 0 t = 72h t = 0 t = 72h [ppm] [ppm]

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Contrairement au cas précédent, le spectre à t = 72 heures est très différent de celui à t = 0, notamment au niveau des protons appartenant aux groupements aryles meso qui passent de deux singulets très larges à d = 7,40 et 7,03 ppm à deux doublets confondus à d = 7,85 ppm. De plus, les signaux caractéristiques du mannose, comme le proton anomère à d = 4,64 ppm, ou encore les multiplets de la chaîne triéthylène glycol entre d = 4,0 et 3,5 ppm ne sont plus visibles dans le spectre à t = 72 heures. Les groupements méthyles N-CH3 passent quant à eux de d = 2,27 à 3,05 ppm. Ces observations semblent indiquer une dégradation du complexe [FbAuSMan] et sont à corroborer avec l’apparition d’un précipité dans le tube RMN au bout de 72 heures. L’analyse par spectrométrie de masse ESI-TOF- de ce précipité montre un signal avec un rapport m/z = 375,10 Da correspondant au dérivé mannose dont la fonction thiol a été oxydée en fonction sulfonate. L’analyse par spectroscopie de masse MALDI-TOF+ de la solution surnageante fait apparaître le pic moléculaire du complexe [FbAuCl] à un rapport m/z = 1139,4 Da. Il semblerait donc que l’1O2 généré par la porphyrine base libre au cours de l’irradiation oxyde l’atome de soufre lié à l’Au(I), ce qui entrainerait la rupture de la liaison Au-S.

Comme nous venons de le voir précédemment, la liaison Au-S du complexe [FbAuSMan] se rompt sous irradiation à la lumière ambiante probablement en raison de l’oxydation de l’atome de soufre, ce qui diminue la stabilité de la liaison Au-S. Pour confirmer cette hypothèse, une expérience supplémentaire a été menée, visant à élucider le mécanisme de rupture de la liaison Au-S. Ainsi, le complexe [FbAuSMan] a été mis en solution dans le toluène avec du chlorure de triméthylhexadécylammonium qui peut jouer le rôle d’agent de transfert de phase et de source d’anions Cl-. Ensuite, de l’eau a été ajoutée et le mélange biphasique obtenu a été agité vigoureusement sous irradiation à l’aide d’une lampe halogène de 500 W pendant 150 minutes. Après irradiation et traitement, les analyses par spectroscopie RMN et par spectrométrie de masse démontre la présence du complexe [FbAuCl] dans la phase organique et d’un dérivé du mannose oxydé en bout de chaîne en phase aqueuse. Cette oxydation opérerait donc selon le mécanisme de la Figure 3.19. Une expérience de contrôle réalisée dans les mêmes conditions mais à l’abri de la lumière ne fait apparaître aucune dégradation du complexe [FbAuSMan] prouvant ainsi que l’oxydation de l’atome de soufre par l’1O2 produit au cours de l’irradiation est probablement responsable de cette photo-dégradation.

Figure 3. 19 Mécanisme d'oxydation du complexe

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Calculs des énergies de liaisons Au-S

Pour rationnaliser ces faits expérimentaux, des calculs DFT de l’énergie de la liaison Au-S en fonction du degré d’oxydation de l’atome de soufre ont été effectués par le Dr. Frederic Tielens du Laboratoire de Chimie de la Matière Condensée à l’Université Pierre et Marie Curie de Paris. Ces calculs se basent sur des modèles simplifiés de [FbAuSMan] dans lesquels le NHC fusionné à la porphyrine a été remplacé par un motif N,N-diméthylbenzimidazol-2-ylidène et où le mannose-thiolate a été remplacé par du méthanethiolate (Figure 3.20). Les énergies des liaisons Au-Cl (Modèle A) et Au-S (Modèles B, C et D) ont été calculées dans le vide et dans l’eau. La liaison Au-SR (Modèle B) est plus stable que la liaison Au-Cl (Modèle A). Cependant, les calculs dans l’eau (comme dans le vide) montrent que l’énergie de liaison Au-S diminue significativement en allant du thiolate (Au-SR, Modèle B) à la sulfone (Au-SO2R, Modèle D). La sulfone est donc un moins bon ligand que Cl-, ce qui est en accord avec la formation du complexe [FbAuCl] de l’espèce oxydée du mannose sous irradiation et en présence d’anions Cl-.

IV Tests de thérapie photodynamique sur cultures cellulaires (in vitro) IV.1 Principe des tests de thérapie photodynamique in vitro

Les tests biologiques ont été effectués avec le Dr. Magali Gary-Bobo et le Dr. Dina Aggad du Laboratoire de Glyco- et Nano-Vecteurs pour le Ciblage Thérapeutique (IBMM, Montpellier). La lignée cellulaire MCF-7 dérivée d’un adénocarcinome mammaire humain et surexprimant les récepteurs au mannose à leur surface a été utilisée pour les tests in vitro en PDT. Ces tests se déroulent selon quatre grandes étapes :

Modèle A Au-Cl Modèle B Au-SR Modèle C Au-S(O)R Modèle D Au-SO2R vide Eau En ér g ie d e li ai so n ( e v )

Figure 3. 20 Haut : modèle simplifié de [FbAuSMan]. Droite :

représentation des énergies des liaisons Au-Cl et Au-S dans l'eau et le vide.

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1. Mise en culture des cellules MCF-7 dans une plaque de culture 96 puits. Cette mise en culture est suivie d’une phase de croissance des cellules de 24 heures.

2. Incubation avec le PS à différentes concentrations. Le temps d’incubation du PS au contact des cellules peut s’étendre d’1 heure à 24 heures suivant la nature du PS. De façon générale, les temps d’incubation courts sont réservés aux PS vectorisés qui profite d’un mode de transport actif.

3. Irradiation des cellules en présence du PS. Le temps, la puissance, ainsi que la longueur d’onde d’irradiation peuvent être modifiés pour s’adapter aux différents types de PS et aux différentes conditions expérimentales. Suite à l’étape d’irradiation, les cellules sont à nouveau incubées 24 heures.

4. Révélation et mise en forme des résultats. La révélation des résultats s’effectue généralement à l’aide du test de révélation au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT).

IV.2 Résultats des tests de thérapie photodynamique in vitro sur cellules