III. Synthèse des résultats
2. Stabilisation des structures formées
J’avais montré lors de mes premiers travaux (Publi. I) que lors de l’excision et de la mise en culture d’une peau de stade HH30, les primordia formés disparaissaient au cours des premières heures de culture et que leur formation était réinduite. Lorsqu’une peau embryonnaire de stade HH31 est mise en culture, la réorganisation ne s’opère pas et les primordia restent stables. La question soulevée par cette observation est l’identification des facteurs de stabilisation des primordia.
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- 91 - i) Rôle des Intégrines
Les Intégrines, par le biais de la Fibronectine, participent activement à la migration des fibroblastes jusqu’à la condensation dermique. J’ai voulu savoir si en bloquant les Intégrines en haute affinité, à l’aide du Manganèse, cation divalent se fixant sur le site MIDAS des Intégrines (Werfel et al., 1996), je parviendrais à modifier la stabilité des primordia nouvellement formés lors de la mise en culture organotypique.
J’ai tout d’abord validé l’utilisation du Manganèse lors d’un test de migration au travers d’une membrane. En ajoutant ce cation, les cellules ne migrent plus, ce qui reflète un arrêt de la dynamique des Intégrines en haute affinité (Publi. I, Fig. 5).
Lorsque je rajoute ce cation dans mon milieu de culture organotypique, au bout de 8 heures de culture, alors qu’avec du milieu témoin les primordia auraient disparu, ces derniers sont toujours en place. Le même résultat est obtenu en utilisant de l’Ionomycine dans le milieu de culture, les primordia restent en place ; phénomène confirmé lors de temps de culture plus long. Les explants ayant été traités à l’Ionomycine développent des bourgeons en cours de croissance alors que ceux cultivés dans les conditions témoins ne parviennent qu’au stade de primordia, et sont donc retardés (Publi. I, Fig. 9). Cette stabilisation est fortement réduite en inhibant la Calcineurine à l’aide de Cyclosporine A (Publi. I, Fig. 9).
Ces résultats montrent que l’engagement des Intégrines pour leurs ligands est important non seulement lors de la mise en place, mais aussi lors de la stabilisation des primordia de phanère. Est-ce la seule voie de signalisation impliquée dans la stabilisation ?
ii) Rôle de la signalisation Notch
La signalisation Notch intervient lors la ségrégation de populations cellulaires, et donc sans doute dans la séparation des domaines folliculaire et interfolliculaire. De nombreuses
protéines impliquées dans cette voie de signalisation sont exprimées lors de la morphogénèse cutanée (Favier et al., 2000; Thelu et al., 1998; Vauclair et al., 2005; Viallet et al., 1998). La première question soulevée est leur chronologie d’expression dans la peau embryonnaire de poulet.
a- Chronologie d’expression des protéines du système Notch
De façon a savoir si la signalisation Notch est impliquée lors de la mise en place, lors de la stabilisation ou lors de ces deux étapes de la morphogénèse cutanée, j’ai comparé les champs fémoraux droit et gauche afin d’étudier les expressions de BMP-2 par rapport à Notch-1, Notch-2, Serrate-2 et Delta-1. J’ai ainsi pu montrer que les éléments de la signalisation Notch n’étaient exprimés qu’après l’expression de BMP-2, donc après la mise en place des primordia de phanère (Publi. III, Fig. 1 et 2).
Cette voie de signalisation semble impliquée lors des phases suivant la mise en place. Mais, quel rôle joue-t-elle ?
b- Implication de Notch sur l’établissement du micropattern
Afin de vérifier si la signalisation Notch influe sur la mise en place de la condensation, j’ai utilisé un inhibiteur de la γ-secretase (protéine clivant la partie intracellulaire de Notch, NICD, élément à l’origine de la transduction du signal) lors de la formation de micromasses (Publi. III, Figure 4). Les micromasses ne se forment pas correctement. La phase d’agrégation et de compaction est retardée.
J’ai alors utilisé le même inhibiteur lors de cultures organotypiques. Après 18 heures de culture, des fusions entre des primordia voisins sont observées. Une forte altération du motif de distribution des primordia sur la peau embryonnaire dorsal se produit lorsque la
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signalisation Notch est inhibée (Publi. I, Fig. 10). Ce rôle de ségrégation des populations cellulaires des domaines folliculaire et interfolliculaire ne pouvant plus avoir lieu, les domaines folliculaires ont tendance à fusionner entre eux.
Est-ce le seul rôle de la signalisation Notch ?
c- Notch et expression de p21WAF1/CIP1
Des travaux antérieurs (Mammucari et al., 2005; Rangarajan et al., 2001) ont montré un lien entre la signalisation Notch et l’expression de p21WAF1CIP1 lors de la différenciation terminale des kératinocytes. L’absence de prolifération cellulaire au sein de la condensation dermique laissait supposer sa présence.
Afin de trouver un lien entre l’arrêt de la prolifération des fibroblastes d’une
condensation dermique et l’expression de p21WAF1/CIP1, j’ai cherché à détecter le taux
d’expression de cette protéine dans les micromasses, tout en analysant par FACS le taux de prolifération des cellules lors de la formation des micromasses. La prolifération cellulaire décroit au cours de la formation des micromasses et dans le même temps, le taux d’expression de la protéine p21WAF1/CIP1 augmente fortement (Publi. III, Fig. 5 et 6).
Il est intéressant de noter que l’inhibition de la signalisation Notch, lors de la formation des micromasses, induit une stabilisation de l’expression de p21WAF1/CIP1 (Publi. III, Fig. 6) s’accompagnant d’une stabilisation de la population cellulaire en phase G1 (Publi. III, Fig. 5). Il y a donc un lien direct entre la stabilisation de la condensation dermique, l’engagement de la signalisation Notch et l’arrêt de la prolifération induite par la protéine
p21WAF1/CIP1.
L’étude de la formation, ainsi que de la stabilisation, de la condensation dermique m’a permis de mettre au point un modèle intégratif (Fig. 19) basé sur l’ensemble des étapes
permettant le passage d’une peau homogène à une peau présentant des primordia de phanère. Ce modèle intégratif a servi de base à l’élaboration d’un modèle mathématique basé, entre autres, sur la migration cellulaire sous le contrôle des facteurs BMP-2 et BMP-7.