Stabilisation de la membrane des érythrocytes humains

Le test de stabilisation membranaire des érythrocytes humains consiste à incuber les extraits ou l'anti-inflammatoire de référence avec une suspension de globules rouges humains, traités avec une solution hypotonique à haute température. L’hémolyse est induite par l'accumulation excessive du liquide dans la cellule, ce qui aboutit à la rupture de la membrane thermiquement fragilisée et provoque la libération de l’hémoglobine et d’autres composants internes dans le fluide environnant (Rahman et al., 2015 ; Labu et al., 2015).

L'effet protecteur des extraits de nopals d'Opuntia de Tissemsilt et du standard, le diclofenac de sodium, contre l'hémolyse induite des globules rouges est illustré par la figure 14. Les extraits de jeunes cladodes étaient plus efficaces que le diclofénac sodique.

L’extrait de caroténoïdes est le seul extrait qui diminue l'hémolyse significativement (p<0.05) en mode dose-dépendant à hauteur de 88.4±1.68% versus 48.97±2.73% pour le diclofénac. L’effet anti-hémolyse des polyphénols et des bétalaïnes, utilisés à 250mg/mL, surpasse positivement mais non significativement (p>0.05) celui du diclofenac et atteint un maximum de stabilisation de l’ordre de 78.16± 1.08% et 66.79 ± 1.09%, respectivement.

Contrairement aux autres biomolécules analysées, les alcaloïdes, utilisés à une concentration de 62.5 μg/mL, ont pu inhiber l'hémolyse de manière non dose-dépendante à

hauteur maximale de 52.38±2.01%. Ce taux d’inhibition chute à 27.21 ± 1.45% avec un extrait à 130 μg/mL d’alcaloïdes.

L’intensité de cet effet anti-hémolytique des différents extraits dans un ordre décroissant s’établit ainsi : caroténoïdes > polyphénols > bétalaïnes > alcaloïdes > diclofenac de sodium avec des différences respectives de 39.43%, 29.19%, 17.82% et 3.41%.

Lorsqu'il est mesuré par rapport à celui des autres extraits, l’effet du diclofénac est dose- dépendant ; ce qui est en accord avec les résultats des travaux de Ghumre et al. (2017). Cependant, d'autres auteurs trouvent que cette règle n'est pas respectée pour d'autres médicaments de référence comme le panadol ou l'ibuprofène (Oyedapo et al., 2010; Ayinke et

al., 2015).

La réponse anti-hémolytique dose-dépendante illustrée par la figure 14 pour les trois extraits, a également été observée par Ghumre et al. (2017), qui ont constaté l'augmentation de la stabilisation membranaire en fonction de l'augmentation des concentrations des métabolites secondaires.

Figure 14: Inhibition de l'hémolyse érythrocytaire par stabilisation de la membrane en présence de différentes concentrations (15.75, 31.25, 62.5, 125 et 250 µg/mL) d’extraits de polyphénols, caroténoïdes,

bétalaïnes et d’alcaloïdes de nopals de l'Opuntia d’Algérie comparés au médicament diclofénac comme anti-inflammatoire standard, le diclofenac de sodium, utilisé aux mêmes concentrations. Les résultats représentent la moyenne ±SD de trois mesures. Les différentes lettres sur les barres (a, b) indiquent une

L'utilisation de la membrane érythrocytaire comme modèle est argumentée par leur ressemblance structurelle avec la membrane des lysosomes impliqués dans la réaction inflammatoire (Hassan et al., 2015). L'altération des membranes lysosomales libère leurs enzymes hydrolytiques dans le cytosol, conduit à la peroxydation lipidique et à la production d'espèces oxydantes, comme elle active les protéines responsables de l'inflammation qui endommagent les organites et les tissus voisins (Oyedapo et al., 2015; Reshma et al., 2014).

Ainsi, la stabilisation des membranes des globules rouges suggère que ces extraits ont la capacité de stabiliser les membranes lysosomales et d'inhiber la libération de leurs constituants pour limiter la réponse inflammatoire. Ce mécanisme est le mode d'action de certains anti- inflammatoires non stéroïdiens et de préparations à base de plantes (Dragan et al., 2016).

La supériorité des caroténoïdes de nopals dans l'inhibition de l'hémolyse est liée à leur lipophilicité qui facilite leur accumulation et interaction dans les compartiments lipidiques comme les membranes. Chew et al. (1991) montrent qu'au sein des cellules, les caroténoïdes sont affiliés à différents types de membranes, comme la membrane cellulaire externe, mais aussi les mitochondries et le noyau, alors que leur présence libre dans le cytosol est plutôt faible. Le rôle filtre des caroténoïdes contre le fluide entourant la cellule est aussi cité par Tian et al. (2009), qui ont noté que la présence de ces pigments dans la membrane de la bactérie

Deinococcus radiodurans participe à leur adaptation aux environnements hypersalins en agissant

comme une barrière contre l'eau et en permettant aux ions et aux molécules d'oxygène de pénétrer à travers la membrane cellulaire.

Il a été établi que la réactivité chimique d'un caroténoïde n'est pas le seul facteur qui détermine sa capacité à protéger les membranes. La position et l'orientation dans la bicouche lipidique membranaire, régie par la structure du caroténoïde, ont un effet significatif également important (Britton, 1995; Woodall et al., 1997). Les xanthophylles «la lutéine, zéaxanthine et β- cryptoxanthine» avec leurs groupes terminaux polaires, sont moins hydrophobes que les carotènes et se situent à l'interface lipide/eau, où ils agissent plus efficacement contre l'oxydation initiée dans les phases aqueuse et lipidique (Surai et al., 2001; Bouayed et Bohn, 2012). Les xanthophylles interviennent sur la largeur de la bicouche membranaire, et offrent une protection aux protéines membranaires (exemple: les glycoprotéines) (Britton, 1995; Rice-Evans et al., 1997; Surai, 2002).

Les carotènes ayant une structure d'hydrocarbure, y compris le β-carotène et le lycopène, sont profondément enchâssés dans le noyau interne hydrophobe. Puisqu'ils ne sont pas en mesure

d'intercepter facilement les radicaux libres provenant de la phase aqueuse et ne captent que ceux de la phase lipidique, les carotènes ne sont pas aussi enclins à inhiber l'oxydation comme les xanthophylles et ils ne protègent que les protéines allouées dans le noyau interne de la membrane (Britton, 1995; Surai et al., 2001; Surai, 2002; El-Agamey et McGarvey, 2008). Dans l'expérience de Stahl et al. (1998), les mélanges de caroténoïdes étaient plus efficaces que les composés uniques et l'effet synergique était plus prononcé lorsque le lycopène ou la lutéine étaient présents.

Selon Tarahovsky et al. (2014), les flavonoïdes peuvent interagir avec la tête polaire des phospholipides à l'interface eau-lipide, entraînant une rigidité de la membrane, une réduction de la fluidité et une amélioration de la stabilité mécanique des bicouches lipidiques. Les tanins possèdent la capacité de se lier aux cations, stabilisant ainsi les membranes érythrocytaires et d'autres macromolécules biologiques (Oyedapo et al., 2010).

Le mode d'action des molécules biologiques comme les polyphénols, pourrait être lié à l'attachement aux membranes érythrocytaires avec altération ultérieure des charges superficielles, pour empêcher l'interaction physique avec les agents d'agrégation ou favoriser la dispersion par répulsion mutuelle des charges similaires impliquées dans l'hémolyse des globules rouges (Oyedapo et al., 2010).

L'incorporation des bétalaïnes aux HRBC a été liée par Tesoriere et al. (2005) à la résistance des érythrocytes à l'hémolyse. Les activités immunosuppressives et anti- inflammatoires des bétalaïnes ont également été confirmées par Gandía Herrero et al. (2016). Sous un autre angle, la réaction anti-hémolytique des bétalaïnes est expliquée par deux modes d’intervention ; le mode interne qui implique une fonction osmolytique des bétalaïnes incorporées stabilisant l'intégrité des cellules à l'état de gonflement ; dans lequel l'efflux de bétalaïnes, décrit comme osmolytes par Sanjay et al. (2013), transporte l'eau avec lui et rétablit le volume normal des cellules. Le mode externe implique la liaison aux membranes cellulaires et le maintien de leur structure et de leurs fonctions, par exemple du repliement protéique des transporteurs et donc de leur capacité de transport, à côté de la préservation de l'intégrité des phospholipides agissant même sur la flexibilité et la résistance de la membrane (Oyedapo et al., 2015; Umapathy et al., 2010).

Malgré le fait que plusieurs études ont montré que les alcaloïdes possèderaient des propriétés anti-inflammatoires, les informations concernant leur effet sur les membranes sont encore très limitées. Les observations faites précédemment sur l'effet pro-oxydant et déstabilisant

des protéines attribué aux alcaloïdes à fortes doses, est incontestablement confirmé et répété dans ce test, qui laisse à prévoir une action pro-inflammatoire directe de ce métabolite à ces concentrations.

Nos résultats précédents sur l'aptitude anti-radicalaire et anti-oxydante des extraits de nopals, jumelée à leur capacité de stabilisation des protéines et protection des lipides, les candidatent comme des effecteurs réels dans le maintien de l'intégrité de ces éléments constitutifs de la membrane, à savoir leur plasticité et fonctionnalité. Cette interprétation corrobore avec la proposition d'Umapathy et al. (2010) qui stipule que l'interaction des extraits avec les protéines membranaires largement responsables des propriétés physiques de la membrane cellulaire, et constituent les canaux ioniques de celle-ci, contribuent à la régulation du volume et de la teneur en eau des cellules grâce au contrôle du mouvement des ions sodium et potassium.

En ce qui concerne l'impact des extraits sur les lipides membranaires, il a été rapporté qu'en raison de leur lipophilicité et de leur propriété spécifique de piéger les radicaux peroxyle, les caroténoïdes joueraient un rôle important dans la protection des membranes cellulaires et des lipoprotéines contre les dommages oxydatifs (Sies et Stahl, 1995). Surai et al. (2001) les considèrent comme faisant partie intégrante des systèmes antioxydants opérant à l'intérieur des membranes dans les systèmes biologiques.

Les principes actifs polyphénoliques maintiennent ainsi l'intégrité membranaire en agissant sur la distribution asymétrique des phospholipides par chélatation des métaux de transition tels que le cuivre et le fer (Chaudhuri et al., 2007; Mladěnka et al., 2011). La quercétine et la quercétine-3-O-glucuronide ont présenté une affinité faible, mais significative, pour les membranes des bicouches phospholipidiques, et pourrait donc être capable d'agir comme des antioxydants efficaces pour les protéger (Del Rio et al., 2013).

De même, l'effet anti-hémolytique des bétalaïnes enregistré dans la présente expérience a également été noté dans de nombreux travaux cités dans l'étude d'Azeredo (2009), où leur action protectrice des globules rouges était liée à l'inhibition de la peroxydation lipidique et de la décomposition de l'hème. Ces pigments bétalaïnes sont considérés comme des molécules cationisées présentant une affinité pour les fragments membranaires, auxquelles ils fournissent la fonction de piégeage des radicaux centrés sur l'oxygène (Kanner et al., 2001, Butera et al., 2002). Les alcaloïdes récupèrent aussi les radicaux libres responsables de la peroxydation des lipides membranaires (Jayakumar et al., 2016).

La stabilisation des membranes des érythrocytes humains contre l'hémolyse hypotonique thermique en présence des extraits de nopals de l'Opuntia d’Algérie, peut indiquer une limitation de la fuite des enzymes hydrolytiques responsables de l'augmentation du stress oxydatif et de la dégradation des tissus, ce qui bloque par la suite cette voie inflammatoire (Drăgan et al., 2016).

Généralement, les extraits aux propriétés de stabilisation membranaire sont bien connus pour leur activité d'interaction avec la phase précoce de la libération des médiateurs inflammatoires (Aitadafoun et al., 1996).