Cette famille qui regroupe le cholestérol et ses dérivés, possède un noyau stérane qui porte un groupement hydroxyle au niveau du carbone 3 (Figure I.2.1.1.2.3.1). Le cholestérol représente la forme la plus répandue de cette catégorie de lipides membranaires chez les vertébrés. Il est présent plus particulièrement dans les membranes érythrocytaires, les membranes plasmiques et dans différents compartiments sub-cellulaires.
Les molécules planes de cholestérol sont constituées d’un squelette hydrocarboné à quatre cycles rigides, adoptant une configuration trans et un groupement hydroxyle en position 3, correspondant à la partie polaire qui lui confère un caractère amphipathique.
Les propriétés physico-chimiques des molécules de cholestérol leurs permettent de s’insérer dans les membranes, de sorte que la partie hydrophile soit orientée vers les têtes polaires (Figure I.2.1.1.2.3.2), tandis que la partie hydrophobe s’insère au niveau du cœur hydrophobe171-173. Leur présence au niveau de la membrane module profondément sa structure, ses propriétés physiques et sa dynamique. Le cholestérol induit une augmentation du paramètre d’ordre au niveau des chaînes alkyles des lipides, ce qui conduit à une
Stérane
!Cholésterol
!Figure I.2.1.1.2.3.1 : Formule chimique du stérane et du cholestérol. Les quatre cycles rigides nommés A, B, C et D adoptent une conformation trans.
augmentation de la rigidité et de l’épaisseur des membranes, tout en maintenant une certaine flexibilité et mobilité des différents composants de la membrane.
Différents travaux effectués par plusieurs groupes mettent en évidence l’importance du cholestérol dans de nombreux processus biologiques tels que l’infection, la réplication (du VIH-1 et d’autre rétrovirus)174 et l’endocytose clathrine-dépendante175,176 de la transferrine et du facteur de croissance épidermique. Il est également impliqué dans le mécanisme d’exocytose, puisque la déplétion en cholestérol induit la dispersion des clusters de protéines SNAREs, impliquées dans l’initiation de la fusion membranaire, conduisant à une réduction massive des vésicules de sécrétion177.
La composition des membranes biologiques est qualifiée d’asymétrique178-182, puisque la répartition des lipides varie au sein des deux feuillets mais également au sein d’un même feuillet. La Figure I.2.1.1.2.2 qui illustre la distribution de quatre phospholipides différents au niveau des membranes des érythrocytes humains182, indique que la phosphatidylcholine et la sphingomyéline sont localisées principalement au niveau du feuillet externe, contrairement à la phosphatidyléthanolamine et la phosphatidylsérine qui sont situées dans le feuillet interne.
D’autre part, il est important à noter que le cholestérol est caractérisé par une capacité de flip-flop assez rapide entre les deux feuillets membranaires, ce qui conduit à sa répartition d’une manière symétrique dans les membranes biologiques.
Cholestérole!
Figure I.2.1.1.2.3.2 : Représentation schématique de l’insertion du cholestérol au niveau des membranes.
I.2.1.2 Des molécules amphiphiles aux systèmes auto-organisés
Amphiphiles par nature, les lipides restent sous forme monomérique en milieu aqueux à l’interface aire-eau, tant que leur concentration est inférieure à une valeur dite « concentration micellaire critique ». Au-delà de cette concentration les lipides disposent d’une grande capacité d’auto-organisation, qui entraîne la formation d’objets de taille et de morphologie différentes183,184 (Figure I.2.1.2.1). En effet en présence d’eau les chaînes aliphatiques hydrophobes forment des pseudo-phases organiques, stabilisées par les interactions attractives entre les différentes parties hydrophobes. Il résulte de cette organisation une réduction des interactions entre les chaînes hydrophobes et les molécules d’eau, tandis que la solvatation des têtes polaires est favorisée. On peut donc résumer la formation de ces objets comme étant la résultante d’un équilibre entre les forces attractives et répulsives et que l’énergie totale du système correspond à la somme de ces énergies. Sur le plan thermodynamique, l’agrégation
Feuillet externe
!Feuillet interne
!Figure I.2.1.1.2.2 : Schéma représentatif de la répartition des quatre principaux lipides des membranes des érythrocytes humains au sein des deux feuillets (d’après Devaux, P. F. 1992). Les résultats sont
des lipides qui conduit à la formation des différents objets est la conséquence des variations d’entropie du système185.
L’énergie n’est pas le seul facteur favorisant la formation et la variation morphologique des agrégats lipidiques. Israelachvili et al en 1976186, ont montré l’importance des contraintes géométriques imposées par la structure des lipides lors de la formation des différents objets (Figue I.2.1.2.2). D’après leurs conclusions, elles sont la conséquence directe des interactions qui peuvent s’établir entre les molécules amphiphiles. Ainsi, ils ont défini un paramètre d’empilement « ρ », tel que décrit dans l’équation 1.
A
!B
!C
!D
!E
!F
!I
!h
!G
!Figure I.2.1.2.1 : Représentation schématique des différentes organisations que peuvent adopter les lipides en milieu aqueux. A. micelles cylindriques ; B. micelles ; C. bicelles ; D. phase hexagonale ; E. phase
cubique inverse ; F. monocouche lipidique ; G. bicouche lamellaire ; H. vésicule lamellaire ; I. phase lamellaire.
Ce paramètre varie de manière proportionnelle avec le volume « ν » des têtes polaires des lipides, il dépend également de l’aire des têtes polaires (a0) et de la longueur « critique » (lc) des chaînes grasses. Dans le modèle d'Israelachvili, lc correspond à la taille maximale pour laquelle la chaîne aliphatique est fluide et non immobilisée dans une structure cristalline.
Il est important de noter, que les trois facteurs qui définissent le paramètre d’empilement, peuvent fluctuer en fonction de la température, de la pression, du pH, de la force ionique et de la concentration en lipides. En effet, l’impact de la salinité du milieu sur la formation de vésicules géantes par électro-formation a été mis en évidence par Angelova qui a montré qu’en présence de concentrations élevées de sel, les répulsions électrostatiques entravent l’auto-organisation des phospholipides en bicouche187.
I.2.1.3 Des membranes biologiques aux membranes modèles
La complexité des membranes biologiques, conduit le plus souvent à l'utilisation de modèles membranaires, visant à comprendre et à déterminer les mécanismes biologiques qui se déroulent à la surface des membranes biologiques. L’avantage de ces modèles membranaires est la possibilité d’en contrôler la taille et la composition lipidique. Ainsi la nature des membranes modèles, bicouche, micelle ou autre, adaptée à différentes utilisations, peut être modulée par le choix de la composition lipidique.
Dans le cadre de nos études, nous avons utilisé des compositions lipidiques différentes à des concentrations supérieures à la concentration micellaire critique (CMC). Les lipides utilisés lors des études structurales par RMN et dichroïsme circulaire, possèdent un paramètre d’empilement ρ < 1/3, permettant ainsi la formation de micelles, suffisamment grandes pour permettre une bonne structuration et stabilisation du peptide. De plus, contrairement aux différents systèmes membranaires modèles, les micelles sont suffisamment petites pour restreindre la taille des complexes peptide-micelle et réduire ainsi la diffusion de spin lors de l’étude RMN. Nous avons également utilisé les lipides ayant un paramètre d’empilement « ρ », tel que 1/2< ρ≤ 1, conduisant ainsi à la formation de vésicules unilamellaires.
! ! ! !!!!!
Figure I.2.1.2.2 : Représentation schématique des relations qui existent entre le paramètre de
I.2.2. Etudes mécanistiques des interactions peptides lytiques‐membranes I.2.2.1 Introduction
Les membranes biologiques dont l’épaisseur varie entre 7 nm et 8 nm sont le support de plusieurs fonctions essentielles, incluant les interactions avec des peptides lytiques. Ces interactions jouent un rôle important dans de nombreux processus, tels que les mécanismes de défense antimicrobiens188-190, la fusion membranaire191-193 ou bien la translocation virale194.
Les peptides lytiques sont en général courts et chargés positivement et les structures qu’adoptent ces peptides sont de trois types : hélice α, feuillet β stabilisés par un ou plusieurs ponts disulfures ou une combinaison des deux195 telle qu’indiqué dans la Figure I.2.2.1.1. Cependant le groupe des peptides en hélice α amphiphile est le plus étudié et le mieux décrit. Ces peptides possèdent généralement de 40% à 60% de résidus hydrophobes196 et sont souvent peu structurés en milieux aqueux. Les peptides tels que l’hémolysine, une exotoxine produite par des bactéries comme le streptocoque et le staphylocoque qui induisent la lyse des globules rouges, adoptent généralement une structure secondaire en hélice droite au contact de la membrane ou dans un environnement mimant la membrane. Cependant, on trouve également quelques structures coudées par la présence d’un ou plusieurs résidus proline telles que la mélittine, principal composant toxique du venin de l’abeille à miel européenne, ou bien le peptide pep46 du virus de la Bursite Infectieuse Aviaire, déstabilisateur de membranes cellulaires permettant l'entrée du virus dans la cellule cible.
C!
B!
A!
Figure I.2.2.1.1 : Structures tertiaires de peptides lytiques (d’après Bullet et al., 2004). A. Structure en
hélice α amphiphile de la magainine. B. Structure en feuillet β de la protégrine I, les ponts disulfures sont
représentés en jaune. C. Structure mixte en hélice α et en feuillet β de défensine I, le feuillet est stabilisé par
I.2.2.2 Les différents modes d’actions des peptides lytiques
La majorité des travaux effectués sur les peptides lytiques mettent en évidence sans ambiguïté, qu’ils ont pour principale fonction de perturber l’intégrité de la bicouche lipidique. Il a été montré que l’interaction des peptides avec les membranes affecte généralement le thermotropisme des phases lamellaires. Au cours de ce processus la température de transition gel-fluide des chaînes aliphatiques reste inchangée, tandis que l’énergie de transition diminue progressivement197.
Les modes d’actions des peptides lytiques sont très divers198-201, ils seront abordés dans cette partie selon deux catégories : ceux qui induisent la formation de pores et ceux qui entraînent la destruction des membranes par « micellisation ». Ces mécanismes largement étudiés, découlent de plusieurs travaux effectués sur des peptides de référence tels que la δ-Lysine202,203, la dermaseptine204 ou bien la maganine 2205, et débutent tous par une première étape d’adsorption des peptides à la surface de la membrane. Cette première étape est caractérisée par deux états, qui sont régis par de nombreux paramètres tels que la composition en phospholipides206, le degré d’hydratation de la membrane207,208, la fluidité membranaire ou la concentration en peptides. Ce modèle à deux états209,210 « two-state model » stipule qu’a faible rapport peptides/lipides, le peptide adsorbé sur les têtes polaires est orienté parallèlement à l’interface de la bicouche lipidique (Figure I.2.2.2.1. A), alors que l’augmentation de ce rapport entraîne une réorientation (Figure I.2.2.2.1. B) du peptide, par rapport à l’interface et conduit à l’initiation du mécanisme de lyse.
B!
A!
Figure I.2.2.2.1 : Modèle à deux états illustrant la réorganisation de la PGla observée dans une membrane modèle de DMPC (Glaser et al., 2005). (A). A faible concentration en peptide l’hélice est parallèle à la