III. 2.3.2.4. Interaction du peptide VP7 23 avec la bicouche d’Egg PC
III.3 Caractérisation structurale du domaine minimum d’interaction avec les
III.3.2. Détermination des éléments de structures secondaires présents dans le
dans le domaine minimum d’interaction, VP723, avec les membranes
modèles par dichroïsme circulaire
Le dichroïsme circulaire (CD) est une technique spectroscopique rapide et simple qui permet d’analyser les structures secondaires présentes dans les protéines et peptides en solution. Il est ainsi possible d’évaluer la conformation du peptide VP723 dans différentes conditions de pH, de sels, de concentration et sa structuration dans différents environnements mimant la membrane.
Dans un premier temps, nous avons enregistré des spectres de dichroïsme circulaire dans les SUVs d’Egg PC et d’extrait cellulaire total de foie, afin d’identifier les structures secondaires que peut adopter le peptide VP723 dans différentes conditions. Cette étude nous a semblé être importante, compte tenu des différences de vitesse de libération de la 6-CF observée en fonction de la composition lipidique des SUVs. Nous avons étudié par CD la structuration du peptide dans des SUVs ainsi qu’en présence de micelles de DPC.
III.3.2.1 Etude de la structuration par dichroïsme circulaire dans les SUVs
Dans le cadre de nos études, les spectres ont été enregistrés à l’aide d’un spectropolarimètre Jobin-Yvon model C8 et une cuve de 0.1 mm d’épaisseur a été utilisée.. Les mesures ont été effectuées à température ambiante dans des SUVs d’Egg PC et des SUVs d’extrait cellulaire total de foie. Les vésicules ont été préparées selon le protocole décrit dans le paragraphe II.1.7.5 (Chapitre II: Matériels et Méthodes). Pour chaque condition, 600 µL d’une solution de 1 mg/mL de SUV ont été préparés, 300 µL de chacune de ces solutions ont été utilisés pour dissoudre 0.1 mg du peptide VP723, et le reste de la solution a été utilisé pour enregistrer le spectre de référence (blanc).
Les spectres de dichroïsme circulaire correspondant au domaine minimum d’interaction avec les membranes, VP723, sont représentés sur la Figure III.3.2.1.1. Respectivement dans des SUVs d’Egg PC (A) et des SUVs d’extrait cellulaire de foie (B). Les résultats ont été exprimés en unité d’ellipticité molaire [Θ] (deg cm2 dmol-1) à partir de l’équation 1, pour une masse moyenne d’acides aminés égale à 128.11 Da.
θ, est l’ellipticité mesurée en degrés. MRW, est masse moyenne des résidus.
C, la concentration en peptide utilisée pour cette étude, exprimée en mg/mL. l, est la longueur du trajet optique en cm.
L’analyse des spectres met en évidence une structuration du peptide VP723 en hélice α faiblement ordonnée (Figure III.3.2.1.1. B) en présence des SUVs d’extrait cellulaire total de foie. En effet deux minima (206 nm et 223 nm) typiques des structures secondaires en hélice α sont observés. L’utilisation d’un mélange lipidique constitué uniquement de L-α-phosphatidylcholine (Egg PC) entraîne un changement conformationnel, qui se traduit par une organisation complète du peptide en hélice α (Figure III.3.2.1.1. A).
Ces expériences indiquent que le peptide VP723, adopte des structures différentes selon la nature des lipides utilisés. Des résultats similaires ont été observés par Abrunhosa289 dont
Figure III.3.2.1.1: Spectres de dichroïsme circulaire mettant en évidence les structures secondaires
qu’adopte le peptide VP723, domaine minimum d’interaction avec les membranes. A. en présence des SUVs
d’Egg PC. B. en présence des SUVs d’extrait cellulaire total de foie. Le rapport peptide/lipide est égal à 1/20 dans les deux conditions de l’étude.
A B !"#$%&" [' ]""(")* +,"#-./ "0% 1"-%23 +)&" 1*4" 1)5" 116" 1,1" 16*" 164" 175" """*" +"*87" +")8*" +")87" +"18*"-2 -1.5 -1 -0.5 0 208 216 224 232 240 248 256 VP23SVPC Theta in Deg !"#$%&" [' ]""(")* +,"#-./ "0% 1"-%23 +)&" -2 -1.5 -1 -0.5 0 200 208 216 224 232 240 248 256 VP23SVEX Theta in Deg """*" +"*45" +")4*" +")45" +"14*" 1**" 1*6" 1)7" 118" 1,1" 18*" 186" 157"
les travaux mettant en évidence l’effet de la composition lipidique sur les structures secondaires qu’adoptent les cecropin A et sur leur capacité à interagir avec les membranes.
D'autres spectres de dichroïsme circulaire du peptide à 30 µM ont été enregistrés en présence de SUVs d'Egg PC ou d'extrait cellulaire du foie, avec un rapport peptide/lipide de 1/100, en préparant les échantillons selon un protocole différent afin de minimiser l'agrégation du peptide. Le peptide à été mis en solution dans un mélange méthanol/chloroforme (1/1 : 50/50μL) et un volume adéquat de cette solution contenant VP723 a été ajouté dans une solution de lipide eux-mêmes solubilisés dans un mélange méthanol/chloroforme (1/1 : 100/100μL). Les solvants organiques ont ensuite été évaporés à sec à l’aide d’un jet d’argon pour former un film lipidique, renfermant le peptide, à la surface d’un tube en verre à bout arrondi, placé sous vide pendant 1 heure, afin d’éliminer toute trace de méthanol et de chloroforme. Ce dernier a été réhydraté avec de l'eau et le pH a été mesuré. Les résultats obtenus sont en accord avec les résultats précédents illustrés dans la Figure III.3.2.1.1 et laissent penser que le peptide était déjà solubilisé dans les conditions précédentes.
La deuxième information fournie par ces spectres concerne le pourcentage d’ellipticité. Les pourcentages d’hélice α ont été déterminés en mesurant le rapport des intensités à 223 nm et à 208 nm et les résultats sont résumés dans le tableau III.3.2.1.1. Nous avons également utilisé l’équation de Chen et al290, donnée si dessous mais les résultats obtenus n’étaient pas cohérents.
Tableau III.3.2.1.1: Pourcentage d’hélice α obtenu en présence des SUVs d’Egg PC. et en présence de
SUVs d’extrait cellulaire total de foie.
Conditions expérimentales Pourcentage d’hélice ! ["]208 ["]220
En présence de SUVs d’Egg PC 98 % 1.653 1.679
En présence de SUVs d’extrait cellulaire total de foie
77 % 1.643 1.262
!!!! !!! ! !"#$
L’augmentation de l’ellipticité et le décalage spectrale des deux minima (de 4 nm ou 2 nm) observés, sont liés à la stabilité de la structure en présence des SUVs d’Egg PC. Ces résultats mettent en évidence que le peptide VP723 adopte une structure en hélice α dans une solution de SUVs constituée de 100% d’Egg PC. La substitution des phosphatidylcholines par d’autres lipides entraine une diminution de la stabilité de la structure déjà existante.
En conclusion, il semble que même si le peptide adopte une structure en hélice alpha dans un milieu mimant l’hydrophobicité des membranes, cette structuration semble directement dépendante du milieu en général et de la composition en lipides des membranes en particulier. Compte tenu des tests de perméabilisation et des résultats de dichroïsme circulaire nous pensons que la structure active du peptide VP723 montrant une grande capacité à perméabiliser les membranes correspond à une hélice α.