A- Peroxydation des phospholipides et perméabilité de la surface cellulaire
L’ozone réagit principalement avec les matières organiques selon le mécanisme de Criegee. Ce mécanisme implique l’ozonolyse des alcènes des chaines polyinsaturées. L’ozone clive la double liaison covalente entre les deux atomes de carbone. Cette première étape conduit à la production de malondialdéhyde. Le malondialdéhyde résulte notamment de l’action de l’ozone sur les phospholipides membranaires polyinsaturés (Iriti & Faoro, 2008). Sa quantification a permis de mettre en évidence le degré de peroxydation des phospholipides membranaires. Sa concentration augmente dès les premières doses d’ozone, quelle que soit l’espèce fongique. L’ozone provoque donc bien l’oxydation des phospholipides membranaires. L’altération des phospholipides, un des constituants majeurs de la membrane plasmique, entraîne la fragilisation de la surface cellulaire et porte atteinte à sa fluidité. Les tests au bleu de Trypan ont montré que l’ozonation entrainait la perte de fonctionnalité de la membrane cellulaire : elle n’est alors plus en mesure de limiter l’entrée du colorant. Cela confirme donc un défaut dans la perméabilité membranaire. Par ailleurs, les images fournies par le MEB mettent en évidence une paroi plissée et détériorée. Il a également été mis en évidence la perte de structures rondes au niveau de la paroi. Or, il a été rapporté dans plusieurs publications la libération des protéines constitutives de la surface cellulaire (Cho et al., 2010; Khadre et al., 2001; Miller et al., 2013). Il est possible de supposer que les structures éliminées sont des glycoprotéines pariétales.
D’autre part, les tests réalisés à l’aide du bleu de Méthylène ont mis en évidence une rétraction du cytoplasme autour du noyau. Ce phénomène fait penser à une plasmolyse qui résulte par définition d’une sortie d’eau de la cellule. Les images fournies par le MEB viennent conforter cette libération de l’eau intracellulaire. En effet, les spores témoins, séchées à l’air libre, ont vu leur structure s’effondrer car initialement trop hydratées. Les spores ozonées, préparées de façon identique, n’ont pas subi cette rétraction. Elles étaient donc probablement déjà moins hydratées. Ainsi, seules les spores ozonées ont montré un phénomène de rétraction cytoplasmique sur les images obtenues après coloration des spores au bleu de Méthylène et semblent être les moins hydratées sur les images de MEB.
161 L’hypothèse d’un phénomène proche d’une plasmolyse ne peut donc pas être exclue et se justifie.
Enfin, la concentration de MDA observée lors de l’ozonation des spores de N.alba montrent trois phases : une augmentation du taux de MDA suivie d’une diminution significative avant une nouvelle hausse. Ainsi, l’oxydation des phospholipides, étape productrice de MDA, serait suivie par la dégradation par l’ozone du MDA. Cho et al (2010) font la même conclusion. La remontée du taux de MDA observée sur les échantillons de
N.alba pourrait se justifier par l’arrivée dans le milieu de composés intracellulaires
fraichement rejetés par la cellule à la paroi altérée ou par l’attaque des acides aminés des protéines membranaires (Iriti & Faoro, 2008; Komanapalli & Lau, 1996).
B- Proposition du mécanisme d’action de l’ozone sur les spores fongiques
L’ozone serait donc un agent de contact, considéré comme étant trop réactif pour pénétrer profondément dans les tissus (Pryor, 1992). La molécule ne diffuse pas dans la spore mais s’attaque directement à la surface cellulaire (Figure 59, étape 1). L’arrivée de l’ozone pourrait en revanche donner lieu à la production de ROS au cœur de la cellule via l’activation de récepteurs membranaires.
Lors de son arrivée au contact de la spore, l’ozone réagit avec les constituants de la paroi puis avec les phospholipides de la membrane plasmique (étape 1A). L’oxydation des phospholipides entraîne la désorganisation de la membrane et la production de MDA. L’ozone s’attaque ensuite aux molécules de MDA nouvelles formées (étape 1B) puis aux protéines de surface libérées (étape 1C). La surface cellulaire a alors perdu sa perméabilité et sa fonctionnalité (Figure 59, étape 2). La cellule se vide de son cytosol.
L’inactivation cellulaire pourrait intervenir soit très précocement dès la peroxydation des phospholipides, soit après l’accumulation de ROS dans la cellule ou suite à la perte du contenu cellulaire. Pour certains auteurs, l’altération de la surface cellulaire suffit à inactiver les micro-organismes (Cho et al., 2010; Scott & Lesher, 1962). Pour d’autres, cette altération n’est qu’une étape avant une série de réactions dans la cellule (Makky et al., 2011; Miller et al., 2013).
162 Etape 1
Etape 2
Détails de l’étape 1
163 C- Perspectives
Des expériences complémentaires permettraient de comprendre l’étape à laquelle intervient la mort cellulaire. Dans le cas de B.cinerea et V.inaequalis, les doses en ozone les plus faibles (avec des temps d’application courts) n’engendrent pas de mortalité. A l’instar de Komanapalli & Lau (1996), quantifier le MDA produit à ces doses permettrait de voir si il y a peroxydation des phospholipides sans inactivation. Toujours pour des doses en ozone faibles ou intermédiaires, un suivi de la quantité de ROS (Reactive Oxygen Species) intracellulaires mis en parallèle avec l’inactivation cellulaire permettrait d’observer les conséquences de l’arrivée de l’ozone sur la paroi et de voir qui de l’ozone ou des ROS provoquent la mort cellulaire. Enfin, des tests enzymatiques sur l’activité d’enzymes responsables de la prise en charge des ROS (Superoxide Dismutase, NADPH oxydase,…) ou encore une quantification moléculaire des gènes de défenses de la spore pourraient être envisagées.