Mesure du degré de peroxydation des phospholipides membranaires

Le(s) mécanisme(s) d’action de l’ozone sur les espèces fongiques reste(nt) incertain(s) et peu d’études ont été menées sur les spores fongiques. S’appuyant sur les données obtenues sur d’autres modèles tels que les bactéries, il est possible d’envisager une détérioration de la surface cellulaire de la spore et notamment une peroxydation des phospholipides membranaires lors de leur contact avec l’ozone.

La quantification du MDA (MalondDiAldéhyde) résultant de l’oxydation des phospholipides a été un moyen d’investigation. Les graphes de la Figure 38 représentent les concentrations en MDA obtenues en fonction des doses d’ozone appliquées par bullage sur les suspensions de spores de B.cinerea, V.inaequalis et N.alba.

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Figure 38 : Concentrations en MDA (en nmol.mL-1) en fonction de la dose d'ozone appliquée sur les spores de (A) B.cinerea, (B) V.inaequalis et (C) N.alba.

Les modalités sont regroupées en groupes statistiquement différents obtenus par Analyse de Variance. Chaque groupe porte une lettre.

(DO) = Dose d’ozone en mg.mL-1 ; (D) = Durée de bullage en minute ; (CO) = Concentration en Ozone dans le gaz entrant (en g.m-3) et (M) = Modalité.

b c d a b c d a (M) (DO) (CO) (D) (M) (DO) (CO) (D) (M) (DO) (CO) (D) A B C

119 La concentration en MDA augmente progressivement avec l’élévation des doses en ozone. En ce qui concerne B.cinerea, une ozonation à 30 g.m-3 pendant deux minutes (modalité 6) augmente significativement la concentration en MDA par rapport aux échantillons témoins, passant de 3,85 à 21,34 nmol/mL de suspension de spores. De même, les échantillons témoins de V.inaequalis ont une concentration moyenne en MDA de 1,30 nmole/mL tandis que les échantillons les plus ozonés ont une concentration en MDA de 29,85 nmole/mL. Ces résultats sont en adéquation avec la littérature. Wu et al. (2011) ont montré que l’application de doses d’ozone croissantes sur Amphidinium sp. (algue marine) entrainait l’augmentation de la concentration en MDA.

Concernant N.alba, le bullage de l’ozone entraîne une production importante de MDA. Pour autant, une diminution de la concentration est à noter entre les modalités 4 et 6, respectivement égales à 37,9 et 29,2 nmol.mL-1. Au-delà de cette dose d’ozone, on constate une nouvelle augmentation de la concentration en MDA produit. Il est possible de faire l’hypothèse qu’à 30 g.m-3 (modalité 6), l’ozone s’attaque aux MDA libérés par la peroxydation des phospholipides. Cho et al. (2010) ont observé une concentration en MDA plus grande pour 0,75 log d’inactivation que pour 1 Log d’inactivation, tout comme cela a été enregistré chez N.alba. Pour eux, ce pic s’explique par le fait que l’ozone finirait par s’attaquer aux molécules de MDA nouvellement produites. Des doses supérieures en ozone entraîneraient la lyse de la membrane avec libération des composés cellulaires, nouvelles cibles d’attaque de l’ozone. Cela entraînerait une nouvelle production de MDA.

Pour confirmer l’hypothèse que la perte de fonctionnalité de la membrane, liée à la peroxydation des phospholipides, explique l’inactivation des spores, nous avons mis en relation le niveau d’oxydation des phospholipides révélée par le MDA avec le taux de germination des spores (Figure 39).

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Figure 39 : Taux de germination (en %) des spores de (A) B.cinerea, (B) V.inaequalis et (C)

N.alba en fonction de la concentration en MDA produit (en nmol/mL d’échantillons).

Plus la concentration en MDA est importante, plus le taux de germination décroît. En l’absence d’ozone, la concentration en MDA est de l’ordre de 2,5 nmol/mL pour les échantillons témoins de N.alba. Le pourcentage de germination est alors de 43,9 %. Quand la quantité de MDA produit augmente, le taux de germination est quasiment nul, de l’ordre de 0,5 % au maximum.

Dans les cas de B.cinerea et de V.inaequalis, cette logique est également respectée. En effet, les échantillons témoins non-ozonés, et donc encore en mesure de se développer, enregistrent les taux de MDA les plus faibles, respectivement de 3,85 et de 1,3 nmol.mL-1. En

A

B

121 revanche, plus les spores sont ozonées, plus la concentration en MDA augmente et plus le taux de germination décroît.

L’augmentation de la quantité de MDA produit est donc directement corrélée avec l’inactivation des spores. Cela corrobore les résultats présentés par Cho, Kim, Kim, Yoon, & Kim (2010) qui montrent que plus l’inactivation d’E.coli est importante, plus la quantité de MDA produit est élevée. La production de MDA serait directement liée à la détérioration de la membrane cellulaire, conduisant à la perte de l’activité respiratoire et finalement à la mort cellulaire.

Dans le cas des trois espèces testées ici, la production de MDA se poursuit même quand les spores ne se développent plus (Figures 39A, 39B et 39C) : les réactions entre l’ozone (ou les radicaux libres) et les composants des spores perdurent même si le stade létal a été atteint. L’ozonation n’entraîne pas simplement un stress oxydatif engendrant la mise en œuvre de défenses qui pourraient générer du MDA mais il s’agit bien de réactions chimiques oxydatives entre phospholipides et ozone qui aboutissent à la formation de MDA. Pour autant, l’hypothèse d’un stress oxydatif et d’une réponse de la spore avant sa mort ne peut être totalement réfutée. Ong & Ali (2015) ont en effet démontré qu’en réponse à une dose en ozone croissante, le nombre de cellules synthétisant des ROS (Reactive Oxigen Species) augmente. Ces ROS proviendraient de la chaîne respiratoire mitochondriale qui est l’une des sources majeures de ROS endogènes, notamment quand la mitochondrie est endommagée. Toutefois, les comptages opérés ensuite montraient que toutes les spores étaient non-viables. Selon ces auteurs, ce serait le cumul de ROS qui entraînerait des détériorations oxydatives et la mort cellulaire. L’altération de la surface cellulaire pourrait être la première étape et non l’unique à l’origine de l’inactivation cellulaire.

B- Evaluation de la fonctionnalité cellulaire