2.2.2.3 Spectroscopie de fluorescence

La fluorescence est une autre technique spectroscopique classique d’étude du comportement de macromolécules en solution. Les trois acides aminés aromatiques (Phe, Tyr et Trp) présentent une fluorescence intrinsèque et peuvent être utilisés comme sondes intramoléculaires de la conformation, de la dynamique et des interactions intermoléculaires d’une protéine. Le tryptophane (Trp) est le chromophore le plus utilisé : la fluorescence de l’indole est très sensible à l’environnement moléculaire (absorption entre 275 et 295 nm, émission entre 320 et 350 nm), ce qui en fait un bon marqueur pour l’étude des modifications conformationnelles ou des interactions d’une protéine avec d’autres molécules [16]. En théorie, si la structure de la protéine était connue, les modifications de fluorescence du tryptophane pourraient apporter des éléments structuraux à une résolution atomique [16]. En pratique, le spectre de fluorescence d’une protéine est le résultat d’une multitude de contributions qui ne peuvent être modélisées aussi précisément.

Dans sa forme la plus simple, la fluorescence permet une mesure de la structure par l’effet de quench de la fluorescence par le solvant. Pour une protéine complètement dénaturée, les résidus tryptophanes sont exposés au solvant et la fluorescence de l’indole est réduite par des collisions avec les molécules du solvant. Par contre, dans une protéine repliée, le noyau indole se retrouvera généralement dans un noyau hydrophobe avec les autres résidus aromatiques. Dans ces conditions, l’intensité de la fluorescence augmente considérablement et de plus, du fait de la constante diélectrique réduite dans la région repliée, le maximum de fluorescence est déplacé [17]. De ce fait, le spectre d’émission en fluorescence apporte des informations sur les éléments structuraux secondaires comportant des résidus aromatiques.

On peut noter un second usage de la fluorescence, la technique dite du FRET, pour « Fluorescent resonance energy transfer » qui permet, en introduisant deux fluorophores susceptibles de transférer l’énergie absorbée de l’un vers l’autre, de mesurer la distance entre ces deux fluorophores [18]. Il convient toutefois de noter que de tels couples sont rarement présents dans l’état natif d’une protéine et qu’il est nécessaire d’ajouter biologiquement ou chimiquement ces chromophores aux protéines à étudier.

Grâce à sa bonne sensibilité (de l’ordre d’une micromole pour la plupart des configurations), la fluorescence peut être utilisée pour l’étude de la structure et du comportement de macromolécules en solution. Les concentrations nécessaires sont de l’ordre de quelques μM. Un des développements les plus récents est l’émergence de la spectroscopie sur molécule unique (acronyme anglais : « Single molecule spectroscopy »). Par cette

ce qui permet d’obtenir des informations uniques sur des sous-populations dans un échantillon hétérogène [20]. L’inconvénient principal de la fluorescence est la nécessité d’avoir des chromophores adaptés, ce qui la limite à des parties de la protéine comportant généralement un tryptophane ou nécessite l’ajout d’un tel chromophore sur les protéines à étudier.

I.2.3. Structure tertiaire

I.2.3.1. Caractéristiques de la structure tertiaire des protéines

La structure tertiaire d’une protéine correspond à sa structure tridimensionnelle d’ensemble, assemblage dans l’espaces des hélices , feuillets  et autres éléments de la structure secondaire. Dans des conditions physicochimiques définies (par exemple, à l’intérieur d’une cellule), une protéine a normalement une structure tridimensionnelle fixée. Il faut noter que cette structure (en solution) n’est pas totalement rigide : la chaîne polypeptidique subit des mouvements thermiques et est susceptible de se déformer lors d’interactions avec d’autres molécules (voir I.3).

Quelles sont les bases énergétiques qui conduisent une protéine à prendre une structure tridimensionnelle bien définie ? Comme on l’a vu plus haut, en dehors des ponts disulfures

qui jouent également un rôle dans la structure tridimensionnelle des protéines, la plupart de ces interactions sont de nature non covalentes. La plupart des types d’interactions non covalentes peut y jouer un rôle. En théorie, la simple connaissance de la structure primaire apportant la nature des acides aminés et leur enchaînement pourrait permettre de calculer ces interactions et de prédire ces structures. En pratique, bien que les progrès dans ce domaine soient constants [21], la détermination théorique ab initio d’une structure de protéine sans références expérimentales reste encore impossible de par la complexité du système.

Les interactions non covalentes permettent toutefois d’expliquer quelques règles générales sur le repliement des protéines [2]. C’est ainsi que « l’intérieur » d’une protéine (c’est-à-dire la partie qui n’est pas accessible au solvant) consiste presque entièrement en résidus apolaires (les acides aminés aliphatiques et aromatiques). En revanche, la « surface » d’une protéine (c’est-à-dire les parties en contact avec le solvant) est constituée essentiellement des résidus polaires ou chargés, comme des lysines et des arginines. Ce partage est une conséquence des interactions hydrophobes (voir I.1.4) qui conduisent les résidus ayant des chaînes latérales apolaires à interagir entre eux plutôt qu’avec le solvant. En revanche, les résidus polaires peuvent former facilement des liaisons hydrogènes avec le solvant et sont donc plus

susceptibles d’être localisés à la surface d’une protéine. La formation des liaisons hydrogènes intramoléculaires contribue essentiellement à la formation des éléments structuraux secondaires (voir I.2.2.1). La plupart des protéines présentent une structure plutôt globulaire, globalement sphérique [6]. On doit noter que cette structure tridimensionnelle est relativement stable et évolue seulement progressivement en fonction des conditions du milieu (pH, température, force ionique, etc.). Toutefois, au-delà d’une certaine limite, la structure est brutalement altérée : la protéine est dénaturée et perd pratiquement toujours sa fonction.

I.2.3.2. Méthodes classiques pour l’étude de la structure tertiaire des

protéines

Pour comprendre l’architecture d’une protéine en détail, l’idéal est de pouvoir déterminer la position exacte de chaque atome de sa structure. Deux méthodes sont particulièrement adaptée à cela : la cristallographie aux rayons X et la résonance magnétique nucléaire (RMN).