La spectrométrie de masse

Couplée à la chromatographie liquide, la spectrométrie de masse (MS) est une technique d’analyse permettant de détecter et d’identifier des molécules par mesure de leur masse, voire de caractériser leur structure chimique. Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). Le spectromètre de masse est composé d’une source d’ionisation, d’un analyseur, d’un détecteur et d’un système de traitement.

La source d’ionisation consiste à vaporiser les molécules et à les ioniser. Elle peut être

utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs types de sources existent et sont utilisés en fonction du résultat recherché et des molécules analysées : l’ionisation électronique (EI), l’ionisation chimique (CI), l’ionisation par bombardement d’atomes rapides (FAB), la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) et, celle utilisée lors de nos analyses, l’ionisation par électronébulisation (électrospray, ESI). Cette dernière permet, sous l'effet d’un champ électrique et grâce éventuellement à un courant d'air coaxial, de transformer le liquide en nuage de fines gouttelettes (spray) chargées suivant le mode d'ionisation. Sous l'effet d'un second courant d'air chauffé, les gouttelettes s'évaporent progressivement. Leur densité de charge devenant trop importante, les gouttelettes explosent en libérant des microgouttelettes constituées de molécules protonées ou déprotonées. Les ions ainsi formés sont ensuite guidés en appliquant une forte différence de potentiel électrique entre l’extrémité de l’émetteur et un orifice situé à proximité. En faisant varier ces potentiels électriques il est possible de provoquer des fragmentations plus ou moins importantes.

L’analyseur sépare les ions en fonction de leur rapport m/z. il existe des analyseurs basse

résolution comme par exemple le quadripôle (Q), et des analyseurs haute résolution permettant de mesurer la masse exacte des analytes comme par exemple le temps de vol (TOF) ou encore l’Orbitrap. Ceux utilisés lors de nos analyses sont :

- l’orbitrap, il se compose d’une électrode creuse à l’intérieur de laquelle est placée parallèlement une électrode en forme de fuseau ; les ions sont injectés au niveau de l’électrode centrale et piégés autour d’elle par la force électrostatique qui compense les forces centrifuges ; le mouvement des ions se décompose alors ainsi : un mouvement circulaire autour de l’électrode centrale dans le plan (xy) et un mouvement oscillatoire de va-et-vient selon l’axe z ; en particulier, les ions d’un m/z donné seront sur la même trajectoire circulaire qui oscille axialement ; le courant induit par ces oscillations permet par une transformée de Fourier, convertissant une représentation temporelle en représentation fréquentielle (et inversement), d’accéder aux m/z,

ions empruntent une trajectoire « rectiligne » déterminée par leur oscillation entre le quadripôle selon le changement de polarité des barres,

- la mesure d’un temps de vol (Time Of Flight : TOF), il consiste à mesurer le temps que met un ion, accéléré préalablement par une tension, à parcourir une distance donnée. Le rapport masse sur charge est directement mesurable à partir du temps de vol. Les ions de rapport m/z le plus petit parviendront au détecteur les premiers.

Le détecteur transforme les ions en signal électrique, plus les ions sont nombreux, plus le

courant est important. Le détecteur amplifie le signal obtenu pour qu’il puisse être traité

informatiquement. Le résultat obtenu est un spectre de masse représentant les rapports m/z.

Les analyseurs peuvent être couplés entre eux pour réaliser des analyses de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Ces analyses permettent d’étudier les filiations ioniques par l’étude de leur fragmentation et de séparer des composés de masses moléculaires différentes au sein d’un mélange. Le triple quadripôle combine deux analyseurs quadripolaires en série, séparés par une cellule de collision. Cette combinaison de quadripôles permet de travailler en MS simple ou en tandem. Ainsi, l’ion parent à étudier est sélectionné par le premier analyseur, selon son rapport m/z, et fragmenté dans la cellule de collision. Le second analyseur est focalisé sur l’ion produit, aussi appelé l’ion fils. Ce mode de fonctionnement présente une double sélectivité, au niveau des sélections de l’ion parent et de l’ion fils. En outre, les deux analyseurs étant fixées à des tensions constantes la sensibilité de détection est améliorée par rapport à d’autres modes de balayage. Le Q-TOF est un hybride qui associe plusieurs types d’analyseur dans un spectromètre de masse en tandem afin de combiner leurs points forts. Ainsi le Q-TOF est constitué d’un double quadripôle et d’un analyseur à temps de vol. Le HRMS (High Resolution Mass Spectrometry) est un spectromètre de masse à haute résolution hybride combinant les performances d’un quadripôle pour la sélection de précurseur avec une grande précision et un Orbitrap pour une détection à haute résolution et grande précision.

Quel que soit le ou les analyseur(s) utilisé(s), la spectrométrie de masse engendre une multitude de données stockées sous forme brute (spectrale par exemple) qui nécessitent un niveau expert pour être traitées, c'est-à-dire traduites en des informations qui identifient et qui quantifient. C’est pourquoi Giacomoni et al. (2015) ont développé, à travers une plateforme collaborative, un protocole sous forme de flux utilisant différents algorithmes permettant de traiter les données en ligne pour la métabolomique : workflow4metabolomics (W4M). Cette plateforme permet d’effectuer le pré- traitement des spectres, transformant les spectres en données numériques, mais aussi de réaliser des analyses statistiques voire l’identification de composés via l’interrogation en ligne de bases de données (figure i.14).

Figure i.14 : Modules disponibles pour les analyses LC-MS (workflow4metabolomics.org). TP1

preprocessing permet de convertir les spectres en données numériques, TP2 statistics mets à disposition des outils statistique et TP3 l’identification de composés.

Le pré-traitement comporte différentes étapes (figure i.15). Le module XcmsSet regroupe des algorithmes permettant d’extraire les signaux relatifs à des ions à partir de chaque échantillon, les pics sont filtrés selon les paramètres choisis et intégrés. Après l’extraction des pics, le module group est un outil qui associe les pics qui correspondent au même analyte dans les échantillons en utilisant le chevauchent m/z. Il permet aussi de rejeter les signaux qui ne sont que partiellement détectés dans les répétitions d'une classe d'échantillon. Après l'appariement des pics en groupes, le module retcor utilise ces groupes pour identifier et corriger les dérives du temps de rétention au cours des analyses. Le module fillPeaks permet de remplacer des valeurs manquantes par l’intensité de la ligne de base. Le module CAMERA (Collection of Algorithms for MEtabolite pRofile Annotation) a pour but principal l'annotation et l'évaluation des données LC-MS. Il inclut des algorithmes pour l'annotation des isotopes, des adduits et des fragments mais aussi des méthodes regroupant des signaux qui proviennent d'un seul métabolite. A l’issue de ce traitement, deux matrices sont créées, la matrice des variables et la matrice des données. La matrice des variables indique leur nom et les décrit par le m/z moyen, minimum, maximum ; le temps de rétention moyen, minimum, maximum ; les adduits et les

isotopes identifiés et le nombre de pics détectés pour chaque groupe d’échantillon. La matrice des données présente l’intensité des signaux pour chacun des échantillons.

Figure i.15 : Les étapes du pré-traitement des spectres aboutissant à une matrice de variables et une

matrice de données. CAMERA annotation des adduits, fragments, et isotopes CAMERA.annotate () Remplacement valeurs manquantes fillPeaks () Correction du temps de rétention retcor () Regroupement des pics group () Filtration et intégration des pics

xcmsSet ()

Matrice de variables Matrice de données

Données brutes LC/MS