4 Spectrométrie de masse

♦ Principe :

Par définition, la spectrométrie de masse permet de transformer des molécules dans leur état naturel en ions à l'état gazeux, et d'obtenir leur masse moléculaire m en analysant leur rapport masse/charge noté m/z, où m est la masse du composé et z sa charge.

Bien qu'il existe plusieurs techniques de spectrométrie de masse, l'appareil utilisé est toujours constitué des parties suivantes :

une source d'ions

un ou plusieurs filtres de masse un détecteur

un enregistreur pour traiter le signal et visualiser les spectres

Deux types de spectromètre ont été utilisés : le spectromètre ESI-Q-TOF et le spectromètre MALDI-TOF.

∆Eq

δ

∆Eq

● le spectromètre ESI-Q-TOF

La source ESI (Electrospray Ionization)

Un échantillon de protéines est mélangé à un solvant volatile (acide), puis introduit dans un capillaire métallique très fin (50 à 100 µM de diamètre interne). Celui-ci est porté à un haut potentiel électrique (106 V/m), sous un flux d’azote à haute température. Ceci provoque la formation d’un nuage de gouttelettes chargées qui sont attirées dans la direction de l'analyseur du spectromètre de masse. Pendant ce transport, la désolvatation progressive des gouttelettes par l’azote gazeux induit une série d'explosions coulombiennes (divisions spontanées de la gouttelette chargée en gouttelettes plus petites, provoquées par une charge surfacique très élevée) qui est à l'origine de la formation des ions multichargés en phase gazeuse.

Figure 20 : principe du système d’ionisation électrospray

L’étape suivante est la séparation des ions générés en fonction de leur rapport masse sur charge (m/z). Celle-ci se déroule au sein de l’analyseur, placé sous vide via une interface. Pour cela, deux techniques sont couramment utilisées : l’analyseur quadripolaire (Q) et l’analyseur temps de vol (TOF : Time of Flight). Il est intéressant de noter que sur les spectromètres de dernière génération, ces deux outils sont couplés (Q-TOF).

L’analyseur quadripolaire : il est formé de quatre électrodes couplées deux à deux où sont

appliquées une tension alternative superposée à une tension continue. Les deux couples d'électrodes permettent d'acheminer les ions jusqu'au détecteur. Les électrodes balayent des gammes de tensions. Ce balayage permet de sélectionner les ions qui entrent en résonance avec la fréquence de la tension alternative. Pour les autres ions, leur amplitude d'oscillation croit exponentiellement. Ils se cognent contre les électrodes et n'atteignent pas le détecteur.

L’analyseur temps de vol : il s’agit d’un tube, libre de champs, qui achemine les ions jusqu'au

N2 N2 échantillon en solution gouttelettes évaporation du solvant

Formation des ions par évaporation depuis la

ions. Or, le temps mis par un ion pour parcourir le tube de vol dépend de son rapport m/z. Si deux ions portent la même charge, l'ion le plus léger arrive au détecteur avant l'ion le plus lourd.

Dans le cas d’un appareil de type ESI-Q-TOF, l’échantillon est ionisé par une source électrospray, puis analysé avec un spectromètre de masse hybride Q-TOF.

Figure 21 : spectromètre Q-TOF couplé à une source électrospray (ESI-Q-TOF)

♦Le spectromètre MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation)-TOF

Une autre technique de ionisation a été utilisée, il s’agit du MALDI. Dans ce cas, 1 volume de solution protéique est mélangé avec 1 volume de solution matrice, acide. Après séchage, la matrice cristallisée est irradiée par un faisceau laser de haute énergie (λ=337 nm). Celle-ci est transmise à l’échantillon qui est ionisé, puis désorbé. Généralement, cette méthode génère des ions mono-chargés, parfois di-chargés. Les peptides chargés sont ensuite analysés par un analyseur TOF.

support Solution cristallisée : matrice + échantillon laser ionisation désorption + - - + détecteur zone libre de champ

♦ Informations obtenues :

La spectrométrie de masse nous informe sur la masse d’une protéine, sa pureté (présence ou non de protéines contaminantes). Elle permet également de déterminer la nature et le nombre d’éventuels atomes fixés sur la protéine (par exemple, fixation de n atomes de soufre fixés de façon covalente à la protéine SufA).

♦ Protocole expérimental :

Toutes les expériences de spectrométrie de masse ont été effectuées en collaboration avec David Lascoux du laboratoire de Spectrométrie de Masse des Protéines dirigé par Eric Forest (LSMP/IBS/Grenoble).

La spectrométrie ESI-Q-TOF a été réalisée sur un spectromètre Q-TOF (Waters). Dans ce cas, deux modes d’analyse ont été utilisés.

Pour les expériences en mode Infusion, les échantillons protéiques sont dilués à 500 nM dans un mélange eau/acétonitrile (1/1, v/v) contenant 0,2% d’acide formique. Ils sont ensuite injectés en continu à un flux de 5 µL/min. Les spectres de masse sont acquis dans une gamme de 700-1600 (m/z), puis traités avec le logiciel MassLinx 4.0 (Waters).

Pour les expériences en mode LC-MS, le spectromètre est couplé à une colonne chromatographique (Poroshell 300SB-C8, 0,5x75 mm 5µ Agilent technologies). Les échantillons protéiques sont dilués à 1 µM environ dans une solution contenant 0,2% d’acide formique. 5 µL de chaque échantillon ainsi préparé sont injectés à un flux continu de 20

µL/min et lavés pendant 50 minutes toujours avec le même tampon (0,2 % d’acide formique) pour éliminer les sels. Les protéines sont ensuite éluées à un flux de 10 µL/min et séparées avec le gradient suivant : 5% à 95% de B pendant 10 minutes et 95% B pendant 5 minutes. (A : 0,2% acide formique, B : 90% acétonitrile et 10% A). Les spectres de masse sont acquis dans une gamme de 500-2000 (m/z), puis traités avec le logiciel MassLinx 4.0 (Waters).

La spectrométrie MALDI-TOF a été effectuée sur un spectromètre Voyager EliteXL (Applied Biosystems). La matrice utilisée était une solution de HCCA (α-cyano-4-hydroxy- trans-cinnamic acid) à demi-saturation, dans un mélange 50/50 eau/acétonitrile, 0,3 % TFA. Après mélange de 1 µL de matrice avec 1 µL d’échantillon, la solution est séchée à l’air. Les ions sont accélérés par un voltage d’extraction de 20 kV. Les spectres de masse ont été obtenus par accumulation de 200 à 1000 tirs de laser.