Le spectromètre de masse

Le spectromètre de masse à été utilisée en tandem, avec un triple quadripôle. Cette structure repose sur l'association de deux analyseurs quadripolaires en série, séparés par une cellule de collision souvent constituée d'un quadripôle plus court. Utilisée avec le mode MRM (Multiple

reaction monitoring), elle permet une double sélectivité avec une première analyse de l’ion

parent et une deuxième analyse de l’ion produit faisant de ce mode, une méthode de choix pour une quantification sensible.

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FIGURE 47 : L’étalon interne [d7 ]-VX-970

Le [d7 ]-VX-970 a la même structure chimique que le VX-970, mais il possède 7 deutériums à

la place des hydrogènes. Il a donc une masse égale à celle du VX-970 + 7 Da.

Le VX-970 réalisa une très bonne ionisation (ANNEXE IV) : • m/z du VX-970 = 464.3 Da> 433.5 Da pour l’ion produit • m/z du [d7 ]-VX-970 = 471.3> = 440.3 Da pour l’ion produit

soit une perte massique de 31 Da pour les deux composés.

4. L’HPLC

La chromatographie a été réalisé en phase inverse.

Comme cité précédemment, la phase mobile de la chromatographie a été un mélange variable d’acétonitrile et de d’eau avec 0.1% d’acide formique dans les deux solvants.

Pour accélérer le processus de passage du VX-970 dans la colonne, il a fallu jouer à la fois sur les paramètres de gradients et de débits des solvants (Figure 48,49).

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FIGURE 48 : Le gradient des solvants pompés en pourcentages en fonction du temps par cycle d’analyse.

FIGURE 49 : Le débit des solvants pompés en fonction du temps par cycle d’analyse

Pour la méthode en phase inverse nous avons comparé 3 colonnes : • Luna Phenylhexyl (50 x 2.0 mm, 3µm), k’ = 3.5

• Synergi Hydro RP 80A (50 x 2.0 mm, 4 µm), k’ = 4.36

• Synergi Polar RP 80A (50 x 2.0 mm, 4 µm), k’= 4.56

Les deux premières colonnes sont responsables de pics asymétriques et de hautes pressions dans la colonne. De ce fait, la 3ème _{colonne fut choisie. Le choix a été confirmé ultérieurement}

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5. Directives de la FDA pour la validation de méthode bio-analytique

Les recommandations de la FDA pour la validation d’une méthode bio-analytique repose sur 7 paramètres :

• l’exactitude c’est-à-dire la proximité entre la concentration réelle et la concentration dosée par la méthode.

• la précision c’est-à-dire la proximité entre les différentes valeurs de concentrations des mesures individuelles effectuées par la méthode

• la récupération compare la concentration d’une solution de VX-970 extraite d’un échantillon de plasma et la concentration d’une même quantité de VX-970 ajouté avant l’extraction. Cette comparaison permet d’évaluer l'effet de matrice potentiel sur le dosage de l'analyte.

• la spécificité, compare 6 lots individuels de plasma humain sans contrôle traités et analysés pour étudier les interférences potentielles des composants de la matrice avec le dosage de l’analyte

• la sensibilité, évalue le rapport de l’aire sous la courbe de la grandeur mesurée à la valeur correspondante de la concentration de l’élément à doser.

• la reproductibilité, compare les résultats individuels obtenus sur le même échantillon soumis à l’essai dans des laboratoires différents et dans les conditions suivantes : analyste différent, appareil différent, jour différent ou même jour

• la stabilité compare les concentrations de plusieurs solutions selon les différentes conditions physiques : 8 mois dans les conditions de stockage à -80°C, 6h dans les conditions de manipulation à température ambiante, 3 jours dans des les conditions de congélation/décongélation, 4h dans le plasma à température ambiante, après réinjection dans l’appareillage 3 jours après une première injection. L’ensemble de ces échantillons est comparé à un échantillon fraichement décongelé et analysé.

La publication est en annexe III.

Peu de temps après la fin de la validation de la méthode, le centre anticancéreux de Pittsburgh faisait son entrée dans l’essai clinique multicentrique de phase I (NCT02595931) évaluant la combinaison VX-970 + irinotécan. Le 1er _{patient traité par la combinaison eu lieu en juin 2016.}

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CONCLUSION

Les dernières années, ont vu opérer un changement de paradigme dans la prise en charge du cancer en passant d’une cancérologie « d’organe » à une cancérologie « stratifiée » et qui de nos jours, devient une cancérologie « personnalisée » dans laquelle les TC jouent un rôle primordial. Cette nouvelle cancérologie s’intègre dans la médecine de précision qui est guidée, dans la mesure du possible, par les caractéristiques moléculaires de la tumeur propre à chaque patient notamment grâce aux biomarqueurs permettant d’identifier les patients porteurs de l’anomalie moléculaire à cibler.

Initialement restreinte à un nombre limité de patients, l’utilisation des TC s’est généralisée à tous les stades de la pathologie pour la grande majorité des localisations tumorales grâce à la découverte de nouvelles cibles et de mécanismes communs à la cancérogénèse, ce qui tend à pouvoir traiter un nombre beaucoup plus grand de sous-groupes de patients. Aujourd’hui les TC représentent plus d’un quart des spécialités antitumorales, dans 98 indications thérapeutiques, ciblant 24 voies oncogéniques. Que ce soit le traitement de la LMC (imatinib) et du cancer du sein HER2+ (trastuzumab) il y a plus de 10 ans, ou l’avènement des CAR-T plus récemment, le ciblage thérapeutique de précision est à l’origine de révolutions dans la prise en charge de nombreux cancer. A l’avenir, une nouvelle vague de bouleversement thérapeutique est attendu, notamment en 1ère _{ligne, du fait de la récente mise sur le marché}

des agents de l’immunothérapie spécifique qui apparait déjà être révolutionnaire par leurs spectres d’activités et pour le taux de survie globale qu’elles engendrent chez les patients traités. Cependant la Financial Toxicity qu’entraine l’utilisation des TC, interroge sur la soutenabilité des systèmes de soins à maintenir un accès à l’innovation et aux meilleurs traitements pour tous les patients dans une pathologie mortelle.

Dans la stratégie d’adopter le ciblage thérapeutique, à l’émergence de clones tumoraux résistants, l’exploitation de la DDR a ouvert une nouvelle voie efficace et pertinente qui a permis la mise sur le marché en 2015 d’un inhibiteur de la protéine PARP dont l’olaparib

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indiqué dans le cancer du sein et de l’ovaire mutés BRCA 1 / 2 opérant par un mécanisme original de létalité synthétique. Depuis le succès des PARPi, les investigations précliniques ont largement exploré les différents phénotypes tumoraux de la DDR afin de les exploiter par des thérapies hautement sélectives. Notons à ce titre l’intérêt grandissant des modèles mathématiques mécanistiques pour l’exploration et les prédictions des comportements des voies de signalisations dans le cadre d’un environnement mutationnel important.

Ces recherches sur le ciblage des voies de la DDR ont notamment révélé le pouvoir potentialisateur des agents endommagent l’ADN que sont la radio-chimiothérapie.

Dans le cadre de cette stratégie, le ciblage de la voie ATR-Chk1 permet d’exploiter les niveaux élevés de stress réplicatifs au sein de la cellule tumorale ainsi que leurs hyper-dépendances au point de contrôle S/G2 du cycle cellulaire. Faisant suite aux résultats favorables des études précliniques sur divers modèles cellulaires et animaux, le VX-970, premier inhibiteur de la protéine ATR entre en essai clinique de phase I en combinaison successive avec deux agents cytotoxiques. Les résultats préliminaires de cette phase I, présentés lors de la session 2016 de l’ASCO semble prometteur. En effet le VX-970 associé à la gemcitabine aurait un profil de toxicité tolérable, une réponse clinique au bout de 12 semaines prometteuse particulièrement marqué chez le phénotype p53 muté et/ou ATM déficient, et une pharmacocinétique approximativement linéaire sans qu’il y ait aucune interaction de la gemcitabine sur son profil cinétique.

En 2017, le VX-970 fait l’objet de 9 essais cliniques dont 3 phases II impliquant la nécessité de sa description pharmacocinétique complète. Dans le but de soutenir ces investigations, nous avons développé une méthode analytique par LC-MS / MS pour la quantification précise, sensible et fiable du VX-970 dans le plasma humain, conformément aux directives de la FDA pour la validation de méthode bio-analytique. Cette méthode pourra être utilisée pour quantifier le VX-970 dans des échantillons de plasma provenant d'essais cliniques en cours et à venir. Nous avons choisi une gamme d’étalonnage englobant l’ensemble du profil cinétique d’un patient traité par VX-970 au sein du centre anticancéreux. De plus, la Cmax de ce profil était largement inférieure à la limite supérieure de quantification, ce qui permettra à la méthode de rester fiable à mesure que la dose et les concentrations sérique augmenteront.

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Après précipitation des protéines plasmatiques, la chromatographie de l’échantillon a été réalisée avec une colonne Phenomenex Polar-RP 80A (4 μm, 50 x 2 mm) et une phase mobile gradient acétonitrile-eau avec 0,1% d'acide formique. La détection a été réalisé par un spectromètre de masse ABI 4000 en mode ionisation positive par électronébulisation (Electrospray Ionization Positive). La méthode de dosage est linéaire pour des concentrations allant de 3 à 5 000 ng / mL et se révèle à la fois précise (94,6-98,5%) et spécifique (CV <8,4%).

En conclusion, nous avons réussi à publier une méthode analytique par LC-MS / MS pour la quantification du VX-970 dans le plasma humain, en couvrant toute la plage de concentration clinique. Ce test pourra être un outil précieux en support du développement clinique du VX- 970 aux résultats précoces prometteurs.

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BIBLIOGRAPHIE

INTRODUCTION

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