Sous-clonage de la 20α-HSD

2.2.1 Digestion et ligation de l’amplicon 20α-HSD et du vecteur de sous-clonage Pgem- 3zf(-)

Afin d’insérer l’amplicon dans le vecteur pGEM-3zf(-), une digestion de l’insert et du vecteur a été faite préalablement avec les enzymes de restriction EcoRI-HF (20 U/µl) (New England BioLabs) et HindIII-HF (20 U/µl) (New England BioLabs) dans du tampon CutSmart (10X) (New England BioLabs). La solution de digestion comprend une concentration finale de 1 U/µl de chaque enzyme, le vecteur ou l’amplicon (20α-HSD), le tampon CutSmart à une concentration finale de 1X et de l’eau. L’incubation a été faite à 37°C pendant 3 heures. Un gel d’agarose 1,8% dans du tampon TAE 1X a été préparé afin de vérifier que la digestion était complète. Par la suite, l’ADN digéré a été purifié avec le QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). La ligation du vecteur et de l’insert (20α-HSD) a été faite avec la ligase T7 (New England BioLabs) et le tampon de ligation commercial (1X) (New England BioLabs) pendant 2 heures à 25°C.

2.2.2 Transformation des bactéries compétentes

Du milieu de culture LB (Luria Broth) (10 g BACTO-Tryptone (Fisher), 5 g extrait de levures (Fisher) et 10 g NaCl dans un volume final de 1 litre à un pH final de 7,0) a été préparé, puis autoclavé. De l’agar (5 g Agar (Fisher) et 300 ml de LB-medium) a également été préparé et envoyé à l’autoclave. De l’ampicilline (0,1 mg/ml) a été ajoutée à l’agar avant de le verser dans les boîtes de Pétri. Avant de faire la transformation des bactéries compétentes, 40 µl d’IPTG 100 mM ont été étalés sur l’agar dans les boîtes de Pétri. Une

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fois séchés, 40 µl de X-Gal (40 mg/ml dans le diméthylformamide) ont été étalés sur l’agar, puis ont été laissés diffuser dans l’agar pendant une heure à la température de la pièce, puis 30 minutes à 37°C. La transformation des bactéries compétentes a débuté en dégelant sur glace un tube de One Shot® _OmniMAXTM _2-T1R _{(Invitrogen). Par la suite, 1µl de la}

réaction de ligation a été ajouté au tube de bactéries E. coli, puis a été mélangé doucement. Ce tube a ensuite été incubé sur glace pendant 30 minutes, puis dans un bain-marie à 42°C pendant 30 secondes et finalement sur glace pendant deux minutes. 250 µl de milieu de culture S.O.C. (invitrogen) à la température de la pièce ont été ajoutés au tube de bactéries. Ce tube a été incubé à 37°C pendant une heure sous une agitation de 150 rpm. Une dilution 1:50 a été faite. À partir de ce tube (tube X), des dilutions 1/2 et 1/5 ont été faites. 150 µl de chacune de ces dilutions (tube X, 1/2, 1/5) ont été étalés sur l’agar contenant l’IPTG et le X-Gal. Ces boîtes de Pétri ont été incubées à 37°C pendant la nuit. Après l’incubation, des colonies blanches et bleues ont été aperçues. S’il y a l’insertion d’un fragment d’ADN dans le vecteur qui a été inséré dans la cellule compétente, la colonie sera blanche. Par contre, en absence d’insertion d’un fragment d’ADN dans le vecteur, la colonie sera bleue. La présence de la coloration bleue est due par l’hydrolysation du X-Gal par la β-galactosidase. La formation du peptide LacZ (dans la cellule bactérienne) est arrêtée lorsqu’un fragment d’ADN est inséré dans le vecteur. Ainsi, la cellule bactérienne n’aura plus d’activité β- galactosidase et elle ne pourra pas hydrolyser le X-Gal présent sur les boîtes de Pétri lorsqu’un segment d’ADN est inséré dans le vecteur.

2.2.3 Production de plasmide en petite quantité

Les colonies blanches, donc celles ayant une insertion d’ADN, ont été sélectionnées pour faire la production de plasmide en petite quantité. La production de plasmide en petite quantité permet de déterminer lesquels des clones contiennent le fragment d’ADN (20α- HSD). Chacune des colonies blanches sélectionnées a été déposée dans 140 ml de milieu de culture LB contenant 140 µl d’ampicilline (1000X) et a été incubée à 37°C pendant 16 heures sous une agitation de 125 rpm, le tube incliné à 45º. Ensuite, 1,5 ml de la culture bactérienne ont été centrifugés. Le surnageant a été enlevé et 200 µl de tampon STET (sucrose 8% (wt/vol), Tris 50 mM pH 8,0, EDTA 50 mM pH 8,0, Triton X-100 5%

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(vol/vol)) ont été ajoutés pour y resuspendre le culot. Vingt (20) µl de lysozyme (10 mg/ml dans Tris-HCl 10 mM, pH 7,8) ont été ajoutés à la solution avant de chauffer le tout à 100°C pendant 40 secondes, puis de centrifuger à 20°C pendant 10 minutes. Le culot a été enlevé. 14 µl de NaCl 5M et 240 µl d’isopropanol ont été ajoutés au surnageant. Le surnageant a été mis sur glace sèche pendant 10 minutes. Il a ensuite été dégelé et centrifugé pendant 15 minutes. Le culot a été complètement séché avant d’être resuspendu dans l’eau distillée. Une double digestion des clones a été faite avec les enzymes de restriction HindIII-HF (High Fidelity) (20 U/µl) et NdeI (20 U/µl) (New England BioLabs). HindIII a été utilisé parce que cette enzyme peut couper le site de restriction présent à la jonction du vecteur et de l’insert (20α-HSD) et NdeI a été utilisé parce que l’enzyme coupe seulement dans le vecteur. Ainsi, la bactérie qui contient le bon insert a un nombre de paires de bases connu. La solution de digestion comprend une concentration finale de 1,33 U/µl de chaque enzyme, l’ADN du clone, le tampon CutSmart à une concentration finale de 1X, de la RNAse A (dégrade les brins d’ARN simples brins) et de l’eau. Le tout a été incubé à 37°C pendant deux heures. Les digestions ont été analysées par électrophorèse et le clone retenu donnait un fragment de 1000 pb, tel qu’attendu.

2.2.4 Culture des clones en grande quantité

Ce clone a été mis en culture en grande quantité. Tout d’abord, la colonie sélectionnée a été piquée et mise en culture dans 20 ml de milieu de culture LB et 20 µl d’ampicilline 1000X. L’incubation a été de 7 heures à 37°C dans un incubateur rotatif à 240 rpm. Par la suite, la culture a été transférée dans 350 ml de milieu frais et 35 µl d’ampicilline 1000X. L’incubation s’est poursuivie pendant 18 heures à 37°C dans un incubateur rotatif à 220 rpm. Pour purifier le plasmide, une maxiprep (Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen)) a été faite en suivant le protocole de cette compagnie.

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2.3 Préparation des sondes pour l’hybridation in situ