Soluciones

• Medio de cultivo de MO

Para preparar 100ml de medio se mezclan:

80 ml de RPMI 1640 20 ml de suero bovino fetal 2 ml de L-glutamina

1,5 ml de penicilina-estreptomicina 1,8 ml de calciparina

El suero bovino fetal se ha de desactivar previamente para evitar la reacción de antígeno-anticuerpo que provocaría su coagulación, para ello se incuba en un baño a 56°C durante 30 minutos agitándolo con frecuencia.

• Soluciones utilizadas en la extracción del cultivo

Hipotónico: KCl 0,075M (0,5522g en 100ml de agua destilada) Carnoy: 3 partes de metanol y una de ácido acético

Es importante preparar ambas soluciones en el momento de utilizarlas para mantener sus propiedades osmóticas y fijadoras, respectivamente.

• Tinción de Bandas G

Colorante Wright: 1,25g de Wright en 500ml de metanol. Se mantiene en agitación durante una hora hasta que esté bien disuelto, se filtra con un papel de filtro y se mantiene en una botella protegida de la luz a 37°C durante tres días. Se conserva a 4°C.

Buffer Sörensen: se prepara a partir de un 50% de solución A y un 50% de solución B.

Solución A: 4,54g de KH2PO4 en 1litro de agua destilada.

Solución B: 5,93g de Na H2PO4 en 1litro de agua destilada.

Se conserva a 4°C.

• Soluciones utilizadas en la técnica de Hibridación in situ

20xSSC: 87,75g de NaCl y 44,1g de citrato de sodio dihidratado en agua tridestilada hasta 500ml. Se ajusta a pH 7 y se esteriliza. Para obtener el 2xSSC se hace una dilución 1/10.

MATERIAL Y MÉTODOS

* Soluciones para el pretratamiento de las preparaciones

Rnasa solución madre 10mg/ml. Se mezclan 25mg de RNAsa en 2,5ml de 2xSSC. Se filtra la solución, se hacen alicuotas de 200µl y se calientan a 100°C durante 15 minutos, con el fin de destruir la DNAsa.

Se conserva a -20°C.

La solución de trabajo consiste en utilizar 150µl de la solución madre por preparación.

Pepsina solución madre 20mg/ml. Se diluye 1g de pepsina en 50ml de agua estéril, se hacen alicuotas de 500µl y se guarda a -20°C.

Antes de utilizarla se disuelven 500µl de la solución madre en 100ml de una solución 0,01N de HCl.

* Solución de post-fijación

10xPBS. Se mezclan 4g de KH2PO4 , 23g de Na H2PO4 y 80g de NaCl en agua tridestilada hasta 1l. Se autoclava. Para obtener el 1xPBS se hace una dilución 1/10.

Formaldehido al 37%. 1,6 ml de formaldehido, 3ml de MgCl2, 6ml de 10xPBS en 49,9ml de agua tridestilada.

* Soluciones de deshidratación etanol al 70%, al 80% y al 100%

* Solución de desnaturalización

Formamida al 70%. 70ml de formamida en 30ml de 2xSSC. Ajustarlo a pH 7. Se prepara en el momento de su utilización.

* Soluciones para el marcaje de la sonda

Solución de marcaje con biotina para 1µg de sonda

Kit Nick Translation BRL: 5µl de 10x dNTP conteniendo biotin-14-dATP y 5µl de una mezcla de enzimas 10x conteniendo DNA polimerasaI y DNA polimerasaI/DNAsaI, en 45µl de agua destilada.

MATERIAL Y MÉTODOS

Solución madre de Stop mix: 4 mg de Bromofenol al 0,1%, 20 mg de Azul dextran al 0,5%, 80µl de NaCl 5M, 800µl de EDTA 0,1M, 30µl de Tris 1M y 4ml de agua tridestilada

Se conserva a -20ºC. Para 1µg de sonda se toman 50µl de la solución madre de stop mix.

DNA humano genómico total (1µg/µl) contiene fragmentos de 200 a 500pb. Se hacen alicuotas de 2µl y se conservan a -20ºC. Se toman 2µl por 1µg de sonda

DNA de esperma de salmón (10µg/µl) contiene fragmentos de 200 a 500pb. Se hacen alicuotas de 1µl y se conservan a -20ºC. Se toman 1µl por 1µg de sonda

Acetato de sodio 2M. Se toman 10µl por 1µg de sonda Etanol al 100%. Se toman 250µl por 1µg de sonda Formamida al 100%. Se toman 10µl por 1µg de sonda

Solución de TE: 0,7878mg de Tris 10mM y 0,1811g de EDTA 1mM en 500ml de agua tridestilada

* Solución de hibridación

Generalmente se toman 10µl sonda por muestra y su contenido varia según el protocolo de la casa comercial que se utilice. En el caso de las sondas con marcaje indirecto por cada 5µl se añade 5µl de la solución madre de master mix.

Solución madre de master mix: 2g de dextrán sulfato al 20%, 1ml de 20xSSC, 9ml de agua tridestilada

* Soluciones de post-hibridación

-Formamida al 50%. 50ml de formamida en 50ml de 2xSSC. Ajustar a pH 7. Se puede conservar a 4°C durante un mes.

* Soluciones de lavado

0,1XSSC: 2,5ml de 20xSSC en 497,5ml agua tridestilada 4XSSC: 100ml de 20xSSC en 400ml de agua tridestilada

Nonidet P40 al 0,1%: 100ml de 20xSSC, 1ml de NP40 en 850ml de agua tridestilada.

Ajustar pH 7. Se conserva a Tª ambiente.

Según la sonda utilizada la solución de lavado será distinta.

MATERIAL Y MÉTODOS

* Soluciones para la amplificación de la señal

Estas soluciones también varían según el protocolo de la casa comercial que suministra la sonda. Aquí se describen las soluciones utilizadas para la amplificación de la señal de las sondas con marcaje indirecto.

Avidina-FITC : solución madre 0,5mg de avidina en 1ml de agua estéril.

Se hacen alicuotas y se guardan en el congelador.

Anticuerpo de cabra anti-avidina biotinilada: solución madre 0,5mg de anti-avidina biotilinada en 1ml de agua estéril.

Se hacen alicuotas y se guardan al congelador.

4xSSC estéril: se filtran 10ml de 4xSSC a través de un filtro millipore de entre 20 y 45µ de diámetro

* Soluciones de contra-tinción

-Ioduro de propidio (IP): solución madre de 1mg de IP en 1ml de agua tridestilada DAPI: solución madre de 5mg de DAPI en 1ml de agua tridestilada

Según el marcaje de la sonda se utilizará una u otra contratinción.

MATERIAL Y MÉTODOS