A recolha de amostras foi efetuada no dia 3 de junho de 2013384, data em que teve início o tratamento de anoxia em ambas as imagens e respetivas urnas. Por conseguinte, procedeu-se à abertura da urna e ao deslocamento da imagem para o exterior (Fig. 156), facilitando a recolha das amostras nas zonas previamente selecionadas385.
A recolha foi efetuada pelo método de recolha convencional com zaragatoa humedecida em solução salina (0,9 % NaCl) estéril, em áreas quadradas de aproximadamente 1-2 cm2.
As amostras foram recolhidas, em duplicado, de diferentes áreas representativas dos têxteis, do corpo e do rosto, num total de 14 amostras (Fig. 157). Seis amostras foram obtidas dos têxteis, nomeadamente da túnica (saia), do peito (renda metálica) e do tecido do suporte (padiola). Outras seis foram recolhidas do corpo, respetivamente do osso da perna direita, do
382
Agradeço ao Sérgio Sousa da Escola Superior de Biotecnologia da Universidade Católica Portuguesa, pela colaboração na recolha de amostras e à colega de mestrado Alexandra Marco pelo registo fotográfico.
383
O estudo microbiológico realizou-se no Centro de Biotecnologia e Química Fina (CBQF) da Escola Superior de Biotecnologia da Universidade Católica Portuguesa (Pólo da Asprela), sob a orientação da coorientadora Doutora Patrícia Moreira da Costa.
384
Importa aqui salientar que a amostragem foi realizada em ambas as imagens-relicário tendo-se procedido ao isolamento e identificação de micro-organismos presentes nas amostras recolhidas de ambas as peças. Contudo, serão apenas mencionados os resultados obtidos da imagem-relicário de Santo Aurélio, por ter sido esta a peça selecionada para investigação e intervenção de conservação no presente trabalho.
385
De modo a tornar a amostragem o mais idónea possível para os intervenientes, o equipamento básico de proteção (luvas e bata), fez-se acompanhar por uma máscara com filtros 3M2138 contra partículas, vapores e gases.
117 crânio e da massa do pulso esquerdo. Por último, obteve-se duas amostras do rosto (tela) (Figs. 158, 159, 160 e 161).
4.2.2. Meios de cultivo
As amostras em solução salina foram usadas para inocular quatro meios de cultivo sólidos em placa de Petri: Nutrient Agar (NA, Merck®), Sabouraud Dextrose Agar (S, Oxoid®), Brain Heart Infusion (BHI, LabM®) e Wilkins-Chalgren Anaerobe Agar (WC, Oxoid®).
O uso de diferentes meios teve como objetivo o isolamento de micro-organismos com diferentes características nutricionais e ambientais, nomeadamente os meios NA e BHI para bactérias aeróbias e leveduras, incluindo possíveis patogénicos, meio S para fungos filamentosos e meio WC para bactérias anaeróbias.
4.2.3. Isolamento e armazenamento de estirpes
Em cada um dos meios foi inoculada, em duplicado, 100 μl de solução de amostra através da técnica de espalhamento em superfície (spread plate), num total de 8 placas para cada amostra.
Os quatro meios foram incubados a diferentes temperaturas e condição de atmosfera durante períodos de tempo distintos. As bactérias e leveduras isoladas em meio NA foram incubadas a 30 ºC em atmosfera aeróbica, de 1 a 2 dias, enquanto os isolados nos meios BHI e WC foram colocadas na incubadora a 37 ºC, em atmosfera aeróbica e anaeróbica386 respetivamente, durante o mesmo período de tempo. As placas em meio S foram incubadas a 30 ºC durante um período máximo de 7 dias.
Os micro-organismos foram sucessivamente reinoculados até se obterem colónias isoladas. Das amostras recolhidas da imagem-relicário de Santo Aurélio obtiveram-se dezoito fungos filamentosos isolados387 em meio S e quarenta e cinco bactérias / leveduras388 nos meios NA e BHI (Tabela 7).
386
A atmosfera anaeróbia foi criada mediante a colocação das placas numa caixa anaerobiose fechada com dois sistemas anaeróbicos (absorventes de oxigénio).
387
De um total de 61 isolados (Santo Aurélio e São Pacífico).
388
De um total de 124 isolados (Santo Aurélio e São Pacífico). Por motivos de contaminação o número de bactérias / leveduras isoladas da imagem de Santo Aurélio não corresponde ao valor publicado no artigo PALMEIRÃO, Joana [et al.] – Ob. cit., p. 430.
118 Para o armazenamento a curto prazo, os fungos filamentosos foram numerados e armazenados em placas de meio S a 4 ºC, para posterior identificação por metodologias de biologia molecular. No total, foram armazenados vinte e sete isolados fúngicos, selecionados com base na observação macro e microscópica das suas características morfológicas.
Para o armazenamento a médio prazo, o micélio foi inoculado em rampas de S e armazenado à mesma temperatura.
As bactérias e leveduras com crescimento de 2 dias foram armazenadas, para longo prazo, por congelamento a -80 ºC em eppendorfs com meio Nutrient Broth (NB, LabM®), no qual foi adicionado 150 μl de glicerol estéril, com vista à sua posterior identificação por métodos de microbiologia clássicos, entre os quais a coloração de Gram e a observação microscópica. Devido à dificuldade de distinguir macroscopicamente entre bactérias e leveduras optou-se por armazenar a totalidade dos isolados com a mesma metodologia.
O isolamento das bactérias em crescimento anaeróbio resultou em cinco isolados diferentes, os quais foram armazenados para posterior identificação por metodologias de biologia molecular.
4.2.4. Identificação dos isolados microbianos por metodologias clássicas
Após a obtenção dos fungos filamentosos isolados em meio S, estes foram analisados por meio da observação macro e microscópica das características morfológicas das suas colónias, com vista à identificação do género.
As características macroscópicas consideradas foram: dimensão (raio); forma; periferia; textura; relevo; cor do verso e reverso da colónia, assim como coloração do meio (Figs. 162 e 163).
Para a observação microscópica foram realizadas montagens das hifas periféricas em água, em lâminas de vidro. Estas foram analisadas ao microscópio ótico (40x e 100x) e fotografadas (Fig. 164). Durante a observação foram examinados o tipo de hifas; forma, tamanho e cor dos esporos; estruturas de resistência; disposição, forma e tamanho dos conídios, entre outros elementos.
O estudo morfológico macro e microscópico permitiu agrupar os fungos em sete grupos e três subgrupos (Tabela 8 e Fig. 165). Um representante de cada grupo e subgrupo foi de seguida
119 selecionado (Fig. 166) para obtenção de micélio para extração de ADN total e posterior identificação por metodologias de biologia molecular389.
4.2.5. Identificação dos isolados por metodologias de biologia molecular390
4.2.5.1. Extração de ADN total
A extração de ADN total foi efetuada, numa primeira fase, com a obtenção de micélio dos fungos isolados, em placa, após um período de crescimento entre 7 a 40 dias. Este período é variável de isolado para isolado. De seguida, frascos de Erlenmeyer de 250 ml com 150 ml de meio líquido Potato Dextrose Broth (PDB, Conda®) foram inoculados com 9 plugs de micélio, de aproximadamente 1 cm de diâmetro, retirados da zona de crescimento radial das placas referidas anteriormente. A inoculação decorreu sem agitação a 30 ºC, aproximadamente entre 10 a 30 dias, até obtenção de micélio em quantidade considerada suficiente para a execução dos passos seguintes (Fig. 167).
Após a incubação, o micélio foi filtrado e lavado com água esterilizada, congelado com azoto líquido (N2), e macerado num almofariz com um pistilo. O micélio em pó foi, de seguida, suspenso em 1,5 ml da solução tampão Tris-EDTA (TE) de pH 7.6, em tubos estéreis Falcon® de 15 ml, e homogeneizado por inversão numa solução de GES (Tiocianato de guanidina 50 M, EDTA 0,1 M e sal de sódio N-laurilsarcosina (Sarkosyl) 0,5 %), seguindo um protocolo adaptado da extração de ADN de acordo com Pitcher, Saunders and Owen391.
Os cinco isolados bacterianos anaeróbios, após crescimento, durante a noite, em meio líquido (Wilkins-Chalgren Anaerobe Broth, Oxoid®) foram centrifugados à velocidade máxima por 5 minutos. O pellet resultante foi, de seguida, lavado duas vezes com a solução tampão TE (Tris-Cl 10mM, EDTA 1mM, pH 8.0). O ADN total das bactérias anaeróbias isoladas foi extraído com a solução GES (Tiocianato de guanidina e sal de sódio N-laurilsarcosina)
389
No Apêndice 1 (Vol. II) estão reunidos os resultados (de biologia molecular) de todos os isolados fúngicos obtidos das imagens-relicário de Santo Aurélio e São Pacífico.
390
A identificação dos isolados fúngicos e bacterianos (parte da extração de ADN dos fungos e extração de ADN dos anaeróbios, todos os PCRs, análise das sequências e comparação com as bases de dados) foi realizada pela coorientadora Doutora Patrícia Moreira a quem, desde já, agradeço a disponibilidade e tempo empregues neste processo. Este processo complementou o isolamento e agrupamento dos isolados fúngicos, os quais foram realizados pela mestranda, e o isolamento dos anaeróbios (crescimento em meio sólido e líquido) realizado pelo Sérgio Sousa a quem agradeço, mais uma vez, a colaboração.
391
PITCHER, D. G.; SAUNDERS, N. A.; OWEN, R. J. – Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Letters in Applied Microbiology. Oxford. Vol. 8, n.º 4 (apr. 1989), p. 151-156.
120 mediante a metodologia de desnaturação adaptada do protocolo de Pitcher, Saunders and Owen392.
4.2.5.2. Amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR)
A identificação dos fungos filamentosos foi efetuada com base na análise da sequência genética da região ITS do ADN ribossomal. O gene que codifica a região ITS, com aproximadamente 600 pares de bases, foi amplificado usando o conjunto de primers (oligonucleotídeos): ITS5 (5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’) e ITS4 (5’
TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’)393
. A qualidade e pureza do ADN fúngico foram avaliadas espectrofotometricamente em dois comprimentos de onda específicos – 260 nm (ARN) e 280 nm (proteínas) –, e por eletroforese em gel de agarose a 1 % em tampão TBE. O ADN foi posteriormente armazenado a -20ºC até nova utilização.
As reações em cadeia da polimerase (PCR) foram realizadas num termociclador automático (TECHNE® TC512) usando 5 μl de ADN total, 25 μl NZYTaq 2x Green Master Mix (NZYtech®), e 2 μl de cada primer num volume final de 50 μl. A amplificação da região ITS por PCR ocorreu através de 35 ciclos com 5 min de desnaturação a 94 ºC, 1 min de desnaturação a 94 ºC, 1 min de anelamento a 50 ºC, 1 min. de extensão a 72 ºC, e finalizada com extensão a 72 ºC durante 5 min.
A identificação das bactérias anaeróbias foi efetuada com base na análise do gene bacteriano rADN 16S. Este, com aproximadamente 1500 pares de bases, entre as posições do nucleotídeos 27 ao 1492 (numeração da sequência do gene rADN 16S da bactéria Escherichia
coli), foi amplificado utilizando o conjunto de primers 27F (3’
GAGTTTGATCCTGGCTCAG 5’) e 1492R (3’ TACCTTGTTACGACTT 5’)394
. A qualidade e pureza do ADN bacteriano foram avaliadas espectrofotometricamente em dois comprimentos de onda específicos – 260 nm (ARN) e 280 nm (proteínas) –, e por eletroforese em gel de agarose a 1 %. O ADN foi posteriormente armazenado a -20ºC até nova utilização. Após verificada a qualidade e pureza do ADN bacteriano realizou-se a amplificação dos genes para sequenciamento e identificação das bactérias isoladas. A amplificação por PCR foi
392
IDEM, Ibidem, p. 151-156.
393
WHITE, Thomas J. [et al.] – Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In INNIS, M. A. [et al.], eds. – PCR protocols: a guide to methods and applications. San Diego: Academic Press, 1990, p. 315-322.
394
BROSIUS, J. [et al.] – Complete nucleotide sequence of a 16s ribosomal RNA gene from Escherichia coli.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Washington, D.C. Vol. 75
121 realizada num termociclador automático (TECHNE® TC512) usando 5 μl de ADN total, 25 μl NZYTaq 2x Green Master Mix (NZYtech®), e 2 μl de cada primer num volume final de 50 μl. A amplificação ocorreu com os primeiros 5 min de desnaturação a 94 ºC seguido de 35 ciclos com as mesmas características, 2 min de desnaturação a 94 ºC, 1 min de anelamento a 51 ºC, 2 min de extensão a 72 ºC, e uma extensão final a 72 ºC durante 5 min.
4.2.5.3. Sequenciamento do ADN
Os produtos amplificados foram purificados e sequenciados por Macrogen Inc, Korea.
As sequências foram manualmente revistas para erros e comparadas com as depositadas no banco público de dados de nucleotídeos do GenBank® através da ferramenta BLASTn® (Basic
Local Alignment Search Tool), disponível no sítio do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov),
com o intuito de identificar cada fungo e bactéria isolados ao táxon de espécie. Foram considerados como confiáveis apenas os fragmentos com similaridade acima dos 98 % (Tabelas 9 e 10).