Séquençage Sanger dans la cohorte d’atteinte hépatique mitochondriale

Le séquençage des 16 exons codants et des 2 exons non codants du gène NOX5 ainsi que leurs régions introniques flanquantes a été réalisé pour l’ensemble des 70 individus de la cohorte d’atteinte hépatique mitochondriale.

Ce séquençage a révélé la présence de mutations seulement chez deux autres patients de la cohorte.

a. Présentation clinique des patients

Figure 41 : Arbre généalogique de la famille TO.

La famille TO est une famille non consanguine Africaine originaire de Côte d’Ivoire (Figure 41). L’enfant TO1 est né à 36 semaines de grossesse. Il a déclaré dès le 14è jour une insuffisance hépatique, une cholestase et un ictère avec un taux de bilirubine totale de 423 µmol/µL. Le bilan biologique montre une hyperlactacidémie (3,5 mM, normale <2,2 mM), une augmentation des ALAT (380 UI/L, normale 5-30) et des ASAT (1200 UI/L, normale 10-40 UI/L), des PAL (831 UI/L, normale 75-240 UI/L) et des gGT (100 UI/L, normale 5-20). Il ne présentait pas de signes neurologiques. La quantité d’ADNmt dans le foie était normale. Les études enzymologiques ont montré un déficit des complexes I et IV sur l’homogénat de foie et sur les mitochondries de muscle. Il est décédé à 3 mois d’une aggravation de son insuffisance hépatique et d’une défaillance multiviscérale.

Figure 42 : Arbre généalogique de la famille BI. 1

La famille BI est une famille non consanguine (Figure 42). Deux premiers enfants sont nés sans problèmes notoires. Le troisième enfant est la fille BI1, née à 38 semaines de grossesse. A J1, elle a déclaré les premiers signes de la maladie : un ictère, la présence de selles blanches et une insuffisance hépatique accompagnée d’une cholestase. Le bilan biologique a montré une hyperlactacidémie, une augmentation des ALAT (64 UI/L, normale 5-30) et des ASAT (146 UI/L, normale 10-40 UI/L), des PAL (831 UI/L, normale 75-240 UI/L) et des gGT (100 UI/L, normale 5-20 UI/L). Elle n’a développé aucun signe neurologique. Elle n’a pas de déplétion de l’ADNmt dans le foie. L’enzymologie montre un déficit du complexe IV dans l’homogénat de foie, et un déficit du complexe I dans les mitochondries de muscle. Elle est décédée à 3 mois d’une aggravation de son insuffisance hépatique, et n’a pas subit de transplantation hépatique du fait de son poids trop faible.

b. Etude biochimique

L’étude en BN-PAGE sur les mitoplastes extraits des fibroblastes des patients TO1 et BI1 n’a pas révélé d’anomalie d’assemblage des complexes de la chaîne respiratoire (Figure 43).

Figure 43 : BN-PAGE réalisé sur les mitoplastes extraits de fibroblastes des patients BI1 et TO1.

Les quantités des complexes I, III, IV et V sont normales chez les patients BI1 et TO1 par rapport au contrôle (CTRL).

c. Etude génétique

Pour le patient BI1, une délétion hétérozygote de trois paires de bases (c. 2193_2195delAAG) dans l’exon 18 du gène NOX5 a été retrouvée. Ceci entraine la perte du résidu Lysine 732 (p.K732del), acide aminé très conservé entre les espèces, dans un domaine Ferric reductase, NAD binding de NOX5. La délétion de la Lysine 732 est prédite comme « possibly damaging » par Polyphen et « deleterious » par SIFT. Cette mutation est transmise par la mère, qui la porte à l’état hétérozygote comme sa fille (Figure 44).

Figure 44 : Haut : Séquences du gène NOX5 montrant la délétion p.K732del retrouvée à l’état hétérozygote chez le patient BI1 et transmise par sa mère. Bas : Conservation de la Lysine 732 entre des orthologues de NOX5.

Pour le patient TO1, nous avons détecté une transition (c. 896C>T) dans l’exon 8 du gène NOX5, conduisant à la modification protéique p.T299M. Cette mutation est transmise par la mère, qui est hétérozygote pour cette mutation également (Figure 45). Cette substitution hétérozygote non synonyme induit le changement de l’acide aminé thréonine en méthionine à la position 299 de la protéine dans le domaine protéique Ferric reductase-like transmembrane component, N- terminal. L’acide aminé thréonine est très conservé entre les espèces. Cette mutation est prédite par Polyphen 2 comme étant « probably damaging » avec un score de 1 sur une échelle allant de 0 à 1 et « deleterious » par SIFT.

Figure 45 : Haut : Séquences du gène NOX5 montrant la substitution p.T299M chez le patient TO1 transmise par sa mère. Bas : Conservation de la Thréonine 299 entre des orthologues de NOX5.

Les patients BI1 et TO1 sont issus de parents non consanguins. Nous recherchons donc sous l’hypothèse d’une maladie récessive la présence de deux mutations hétérozygotes composites. Puisque nous n’avons pas détecté d’autre mutation dans les exons et les régions introniques flanquantes de l’ADN génomique de ces patients, nous avons alors étudié les transcrits de NOX5 afin de détecter d’éventuelles anomalies qualitatives ou quantitatives, reflet de la présence d’une mutation intronique.

Nous avons effectué une reverse transcription sur l’ARN extrait de cultures de fibroblastes de chaque patient. L’ADNc du gène NOX5 a été amplifié à l’aide d’amorces exoniques, puis séquencé.

La délétion hétérozygote c. 2193_2195delAAG a été retrouvée sur l’ADNc du patient BI1 à l’état hétérozygote (Figure 46). Le séquençage de l’intégralité de l’ADNc du patient n’a pas montré d’autres anomalies.

Figure 46 : Séquences de l’ADNg et de l’ADNc NOX5 montrant la présence de la délétion p.K732del chez la patiente BI1.

La substitution c. 896C>T présente à l’état hétérozygote sur ADN génomique n’a pas été retrouvée sur l’ADNc du gène NOX5 du patient TO1 (Figure 47). Ceci nous indique que cette mutation engendre une déstabilisation de l’ARNm. Afin de pouvoir amplifier et séquencer cet ARNm instable, nous avons par la suite traité les cellules du patient à la puromycine, qui permet

d’augmenter la stabilité d’une espèce d’ARN instable. Nous n’avons pas réussi à obtenir cette espèce d’ARNm, car nous n’obtenons après traitement à la puromycine toujours que l’ARNm sauvage (Figure 47).

Figure 47 : Séquences de l’ADNg et de l’ADNc NOX5 montrant l’absence de la substitution p.T299M sur l’ADNc (normal et traité avec de la puromycine) du patient TO1.