L’approche des PCR longues est très similaire à celle d’une approche par PCR classique. L’enzyme permettant la réaction et le tampon de cette enzyme diffèrent de la PCR habituelle, et un allongement du temps d’élongation permet d’obtenir des amplicons pouvant faire jusqu’à une longueur de 10kb. Le génome mitochondrial ayant une taille de l’ordre de 15kb, seulement quelques fragments chevauchants permettent d’assembler un mitogénome complet. Une condition préalable pour obtenir des amplicons de grande taille est que l’ADN natif servant de matrice pour initier l’amplification ne soit pas trop fragmenté. L’approche par PCR repose sur la définition d’un couple d’amorces qui, en s’hybridant sur l’ADN dénaturé de part et d’autre du fragment ciblé, permettent de répliquer l’ADN à l’aide d’une polymérase. Les amorces universelles définies pour les quelques gènes mitochondriaux classiquement utilisés dans les approches de phylogénie ne sont généralement pas suffisantes pour amplifier le génome mitochondrial entier, car leur proximité sur le génome demanderait d’amplifier des fragments de très grande taille. Notamment, l’organisation des gènes doit être préalablement connue pour s’assurer de la longueur des fragments amplifiés avec les amorces disponibles et de leur degré de chevauchement. Pour cela, il est nécessaire de disposer de mitogénomes d’espèces les plus proches possible phylogénétiquement. A l’aide de ces références, de nouvelles amorces peuvent ainsi être dessinées. Cinq mitogénomes de quatre espèces de Bythograeidae sont disponibles dans la base de données NCBI et nous ont servi à dessiner des amorces et prédire la taille des fragments amplifiés par celles-ci. Ces cinq mitogénomes sont ceux de : Austinograea alayseae et Austinograea rodriguezensis (NC_020314 et NC_020312, Yang et al.,
l’ensemble des séquences mitochondriales de Segonzacia mesatlantica disponibles dans NCBI à savoir les séquences partielles de COI, 16S et cytochrome oxydase b, issues de Mateos et al., 2012 (JQ407473, JQ407447 et JQ407417, respectivement). Neuf amorces (tableau III.1) sont dessinées en plus des amorces universelles LCOI, HCOI (Folmer et al., 1994) et 12S-R (Simon et al., 1994) afin d’amplifier huit fragments se chevauchant. Les amorces peuvent s'hybrider même si leur séquence diffère de quelques nucléotides par rapport à la séquence d’ADN cible. De ce fait, les séquences correspondant aux zones d’hybridations d’amorces sont artéfactuellement identiques à celles des amorces. Les séquences correspondant à ces dernières ont donc été éliminées à la suite de l’assemblage* et une attention particulière a été portée pour que chaque zone d’hybridation d’une amorce soit également dans une zone de recouvrement entre fragments. Le dessin des amorces se fait avec l’outil Add annotation proposé par le logiciel Genious v.9.1.7 (Kearse et al., 2012). Les amorces ont été dessinées dans les zones les plus conservées possible, en faisant l’hypothèse que la séquence de Segonzacia mesatlantica est suffisamment similaire aux séquences des autres espèces de Bythograeidae disponibles pour permettre aux amorces de s’hybrider. Chaque amorce est dessinée de manière à avoir une température d’hybridation (Tm) attendue autour de 60°C. L’absence d’homodimères (hybridation entre deux séquences d’une même amorce) et de hairpin (hybridation au sein d’une même amorce) ont été vérifiées sur le logiciel Genious. La possibilité d’hétérodimères (hybridation entre les séquences de deux amorces différentes (typiquement sens et anti-sens) n’a pas été vérifiée.
Les réactions de PCR longues ont été effectuées sur le spécimen MNHN-IU-2013-15617 en suivant le protocole de Hinsinger et al., 2015 avec quelques modifications : les réactions de PCR se sont déroulées dans un volume total de 18 µL comprenant du tampon de réaction pour la Taq LongAmp, 0,4 ng/µL de Sérum Albumine de Bovin (BSA), 3,5% de DMSO, 300 nM de chaque amorce, 300 µM de dNTPs et 1 unité de Taq polymérase LongAmp (Biolabs). Après une étape initiale de dénaturation de 30 secondes à 94°C, l’ADN a été amplifié en faisant 37 cycles de 20 secondes de dénaturation à 94°C suivies de 30 secondes d’hybridation des amorces suivies de 15 minutes d’élongation à 65°C. L’amplification est finalisée par une dernière étape d’élongation de 15 minutes à 65°C. Deux températures d’hybridation, 50°C et 55°C, ont été testées. La PCR comportant l’amorce sens PM_COI-78 a été effectuée avec 2 amorces anti-sens mises en quantités équivalentes dans le mélange PCR : l’amorce PM_Asn-4618 et l’amorce PM_Asn-4631, car ces deux fragments sont différents de seulement 13 nucléotides. La présence d’un produit de la taille attendue a été vérifiée par révélation aux UV de la migration sur gel d’agarose à 0,75% des produits de PCR. L’ensemble des PCR ayant produit une amplification ont été séquencées en suivant la méthode
Tableau III.1 Nom, séquences (5'-3'), sens d’utilisation de l’amorce (F pour Forward = sens ; R pour Reverse = anti-sens) et provenance des amorces utilisées pour l'amplification du mitogénome de Segonzacia mesatlantica.
Nom de l'amorce Séquence (5'- 3') Sens Etude
PM_COX178 AGTAGGAACATCTCTAAGTCTAATTATCCG F Cette étude
PM_COX1674 AATAAGTGTTGGTAAAGAACGGGGTC R Cette étude
PM_Ala4502 TGATATATGAGTTGCATTCATAAGGAGTTC F Cette étude
PM_Asn4618 GTGACATACCTCTAGTTTGGTTTCTATC R Cette étude
PM_Asn4631 TTTGTCATTAACAGTGACATACCTCTAG R Cette étude
PM_Cytb9582 GTAGATAACGCCACCTTAACTCGA F Cette étude
PM_cytb9720 AGTAAGGGTGGAATGGGAGTTTATC R Cette étude
PM_16s11425 CAAGAGATAGAAACCGACCTGGC F Cette étude
PM_16s11909 TGACCGTGCAAAGGTAGCATAATAATTAG R Cette étude
LCOI-1490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTG F Folmer, 1994
HCOI-2198 TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA R Folmer, 1994
d’Hinsinger et al. (2015). Les reads* issus du séquençage ont été une première fois cartographiés de manière itérative (25 cycles) indépendamment sur les mitogénomes de référence de Gandalfus
yunohana (NC_013713) et d’Austinograea alayseae (NC_020314) avec un maximum de 10% de
nucléotides divergents autorisé par read avec le logiciel Geneious. Les séquences consensus ont été vérifiées à la main (vérification de l’alignement des reads, suppression des séquences correspondant aux amorces) avant de servir de nouvelle référence pour une seconde cartographie des reads de séquençage avec un maximum de 3% de nucléotides divergents tolérés par read (25 cycles itératifs). Les deux séquences consensus obtenues avec chacun des mitogénomes de référence ont ensuite été comparées pour vérifier la congruence des séquences. Les cadres de lecture des gènes codants ont été vérifiés à la main. L’annotation du mitogénome a été effectuée avec le logiciel Geneious et vérifiée avec le serveur web MITOS (Bernt et al., 2013).