61 réducteur des ponts disulfures ; mettent en évidence les différentes sous unités d’une protéine,
II. 5.6.2.2 Séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide PAGE
Chauffage 5min en Bain marie
Conservation à - 20°C
Figure 31 : Etapes de la dénaturation des protéines.
II.5.6.2.2 Séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide PAGE
- Préparation des gels
Pour la préparation des gels, on réalise des gels en discontinus c'est-à-dire qu’ils sont composés de zones comprenant des pourcentages acrylamide/bisacrylamide différents :
- La première partie du gel est un gel de concentration (stacking gel 3,75 %) qui permet une entrée homogène des protéines dans le gel (Annexe 2).
- La seconde partie est le gel de séparation (Resolving gel 12 %) à l’intérieur duquel les protéines sont séparées en fonction de leur poids moléculaire (Annexe 2).
Après la préparation des gels Stacking et Résolving, on commence par remplir les plaques avec le gel de séparation (tout en laissant un espace d’environ 1-2 cm avant le sommet), et rapidement, on remplit le vide avec une solution d’alcool. La polymérisation du
100 μl de l’échantillon à analyser
+
20 μl de tampon dénaturant
Compléter la dénaturation
Matériel et Méthodes
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gel dure environ 25 - 30 minutes. Après polymérisation, on élimine l’alcool et on essuie lereste avec du papier absorbant. Puis, on ajoute le gel de concentration rapidement, après préparation en surmontant les plaques par le peigne approprié, après polymérisation du gel Stacking, le peigne est retiré formant ainsi les 10 puits. La taille et le nombre des dents des peignes sont variables ce qui permet de déposer des volumes allant de 10 µ L à 30µ L d'échantillon de protéines à séparer.
Le coulage des gels entre deux plaques en verre leur confèrent une épaisseur d’un mm Sur chaque gel, on dépose dans le premier puit, une solution contenant des protéines recombinantes pré-marquées au bleu (marqueurs de masses moléculaires) qui proviennent de chez Bio-Rad (#161-0305) permettant d'estimer de haut en bas la distance de migration et étant par ordre décroissant comme suit (kDa) : 106, 97, 50, 36, 28,19.
Les échantillons de protéines dénaturées sont déposés dans les puits après leurs décongélations. Ensuite, on remplit la cuve avec le tampon de migration (pH 8,3), les plaques de verre contenant le gel polymérisé sont placées dans une cuve d'électrophorèse avec un tampon de migration (Annexe 2).
Puis, on relie la cuve à un générateur, générant un courant électrique (1000 mA, 300 W) faisant migrer les protéines, d’abord à 80 volts pendant (15min -1h) afin de concentrer les protéines dans le premier gel de stacking. Ce fort courant électrique force la migration de la glycine et des protéines qui vont stocker au front de migration des ions chlorure et d’obtenir ainsi de très fines bandes de protéines concentrées à la limite supérieure du second gel.
Enfin, ce dernier gel de séparation (résolving), permet de séparer les protéines selon un gradient de taille, par un maillage moléculaire, en augmentant le potentiel électrique à 145 volts pendant 2h environ. Toute cette opération est réalisée à température ambiante.
- Coloration au bleu de Coomassie et détermination de la masse molaire (MM) des protéines
Après la migration, le gel est démoulé, et les protéines sont fixées dans une solution de fixation (Annexe 2) ; le gel est ensuite mis dans une solution de coloration au bleu de Coomassie R 250, pendant au moins 20 min sous agitation.
Ensuite, on décolore le gel par des lavages successifs et sous agitation dans une solution de décoloration, qui la même solution que celle ayant servie à la fixation des protéines jusqu'à bonne lisibilité des bandes protéiques. Les différentes étapes de l’électrophorèse sont présentées dans la figure 32.
Matériel et Méthodes
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Figure 32 : Les différentes étapes de l’électrophorèse SDS-PAGE.
- Lecture et estimation des poids moléculaires
Les poids moléculaires des bandes protéiques apparues sur le gel ont été estimés à l’aide du logiciel Un-Scan-It gel 6.5 (Silk Scientific, Orem, UT).
II.5.6.3 Estimation de la tendreté par pénétromètrie
• But : réaliser la mesure instrumentale de la dureté des morceaux de viande.
• Principe : afin d’estimer la tendreté de nos échantillons de viande cunicole, nous
avons utilisé un instrument de mesure « le pénétromètre » (PETROTEST PNR 10 Germany) (Annexe 4), ce dernier est muni d’un corps pénétrant sous forme de cône, qui a la possibilité de pénétrer en chute libre dans la viande sous l’action de son propre poids (pèse 2,5 g), pendant un temps déterminé (Figure 33). La profondeur de pénétration est mesurée en 1 / 10 mm ou unité de pénétration (1 UP = 0.1 mm) constitue alors une grandeur objective de la consistance de la substance analysée et permet donc une mesure de la tendreté (Becila, 2009).
• Mode opératoire : Dans notre étude, les échantillons de viande ont été coupés sous
forme rectangulaire de dimensions (longueur = 2 cm, largeur = 1 cm, hauteur =2 cm), il est recommandé d’éviter au maximum les parties contenant beaucoup de collagène ou de tissu adipeux, le morceau de viande est placé sur le support du pénétromètre de façon à ce que la contrainte appliquée soit perpendiculaire aux fibres musculaires. La profondeur de pénétration maximale est affichée en millimètres après un temps de 5 secondes, ou l’ensemble corps pénétrant/tige est libéré. Une valeur élevée de la profondeur de pénétration correspond à une viande très tendre. Une valeur faible indique que la viande est dure (Herkati, 2007 ; Becila et al. 2014 ; Hafid, 2015) comme montré dans la figure 33.
Un échantillon est prélevé pour chaque point de la cinétique suivante : 0h, 1h, 6h, 24h, 48h post mortem, la valeur de profondeur de pénétration est la moyenne de 5 répétitions pour chaque morceau.
Matériel et Méthodes
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II.5.6.4 Evaluation sensorielle
La dégustation représente un outil pour apprécier les qualités organoleptiques d’un aliment. L’analyse sensorielle fait l’objet d’une définition par l’AFNOR : c’est « l’examen des propriétés d’un produit par les organes des sens ». Ainsi, elle représente une méthode subjective d’analyse des aliments que l’on peut mettre à côté des méthodes objectives instrumentales (Delagnes, 1996).
- Préparation des échantillons
Afin de réaliser l’analyse sensorielle les cuisses des lapins ont été utilisées, chaque cuisse est découpée en 10 morceaux semblables, placés dans des sacs de cuisson étiquetés et bien scellés, et immergés dans un bain-marie maintenu à température constante de 80°C pendant environ 1h (Honikel, 1998). Ce mode de cuisson a été choisi afin d’assurer un régime thermique homogène à la surface et à l'intérieur de l’échantillon. Il permet également d’avoir une texture homogène en évitant la formation de croûte à la surface (Laroche, 1983 ; Hernandez et al., 1999). Après le temps de cuisson, les échantillons sont transportés immédiatement vers la salle de dégustation pour être servis à chaud aux dégustateurs.
- Salle de dégustation
La salle de dégustation située dans le voisinage immédiat du laboratoire a été équipée de 10 cabines individuelles permettant l’isolement des dégustateurs. Cette dernière a été aménagée de façon à garantir un maximum de confort et de concentration aux juges à savoir : la propreté et utilisation d’un éclairage artificiel non coloré, absence de sources de distraction, d'odeurs, de bruits, de cadres, décorations…etc
Matériel et Méthodes
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- DégustateursNous avons sélectionné des jurys de 10 sujets (enseignants, étudiants post- gradués, fin de cycle de graduation, et personnel du laboratoire) initiés à l’analyse sensorielle de par leur formation et donc considérés comme qualifiés à ce genre d’analyse. En plus, une séance de formation a été réalisée au profit des sujets permettant de se familiariser avec le vocabulaire, d'apprendre à évaluer les produits, d'augmenter leurs connaissances sensorielles, et de donner des jugements purement qualitatifs sans tenir compte de leurs préférences,
- Test sensoriel
Pour l’analyse sensorielle, nous avons utilisé le protocole adapté de (Gagaoua et al., 2013 ; Juin et al., 1998). En premier lieu, les candidats évaluent les deux échantillons de viande cuit de deux races de lapin, séparément, pour une liste de huit attributs sensoriels à savoir : la flaveur, la jutosité, la tendreté, la cohésion, la mastication, aspect fibreux, aspect farineux, présence de résidus, ainsi que l’appréciation globale sur une échelle non structurée de 10 cm. En effet, pour chaque attribut, l’échelle va du score le plus faible vers le plus important (Annexe 5). En deuxième lieu, un test de préférence par paires a été utilisé (Annexe 5), dans lequel, le dégustateur va choisir entre deux échantillons de viande selon le degré de préférence (Watts et al., 1989).
Chaque dégustateur trouve dans sa cabine, en plus de deux assiettes codées contenant les deux échantillons de viande lapine (race locale et étrangère), un gobelet contenant de l’eau (90%) et du jus de pomme (10%) pour nettoyer le palais entre les échantillons, ainsi que les deux bulletins d’évaluation sensorielle (Tableau 5) accompagnés d’une liste de définitions pour l’ensemble des attributs (Figure 34).
Les séances de dégustation se sont déroulés entre 10h et 11h 30 du matin ou l’après-midi entre 14h et 15.30h afin d’éviter les situations critiques (faim, satiété, fatigue et stress)
Matériel et Méthodes
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Tableau 5 : Test de préférence par paires, et définition des attributs évalués durant les
analyses sensorielles de la viande (Peachey et al., 2002 ; Juin et al ., 1998).
N° Attribut
sensoriel
Définitions
1 (Odeur et Flaveur
goût)
L’intensité de saveur du morceau de viande
Faible flaveur à forte flaveur
2 Jutosité
Aptitude de la viande à rendre du jus à la mastication
Non juteux à extrêmement juteux
3
Tendreté Aptitude de la viande à se laisser facilement découper, déchirer et broyer pendant la mastication
De dur à extrêmement tendre
4 Cohésion
Comment le morceau de viande fragmente-il à la troisième mastication ?
De faiblement cohésif (se fragmentant seul) à très cohésif (le morceau garde son intégrité)
5 Mastication
Nombre de fois nécessaires à mâcher le morceau de viande avant de pouvoir l’avaler
Pas difficile à mâcher à extrêmement difficile à mâcher
6 Aspect
farineux
Sensation de farine lors de la mastication
De faible à forte sensation
7 Aspect
fibreux
Perception de fibres de la viande lors de la mastication
De peu fibreux à fibreux
8 Présence de
résidus
Quantité de résidus après dégustation
Du néant à l’extrême
II.6 Analyse statistique
Les données expérimentales sont présentées sous forme de moyennes ± d’écarts-type de trois expériences.
• Le coefficient de variation (CV) est calculé selon la formule : CV= (écart-type/moyenne × 100)
• La comparaison statistique entre deux moyenne au seuil de signification 5% est
réalisée à l’aide du test t de Student ;
• Pour confirmer ou infirmer la présence d’une différence significative de certains facteurs de mesure des données expérimentales, une analyse de la variance (ANOVA) au seuil de 5% est effectuée par l’utilisation du logiciel STATGRAPHICS (2009).
-Test de préférence par paires-