Sélection et purification des colonies suspectes

Des colonies représentatives présentant les caractères culturaux d’entérobactéries à savoir la couleur rose ou rouge, ont été repiquées sur le même milieu en vue de les obtenir en culture pure afin de les identifier.

Les cultures obtenues ont fait l’objet de l’examen microscopique à l’objectif X100 à immersion après coloration de Gram, permettant la sélection de celles répondant aux caractéristiques microscopiques des entérobactéries (bacilles ou coccobacilles à Gram négatif) et de vérifier la taille, la forme ainsi que l’arrangement cellulaire. La technique est décrite dans la partie annexe (N°1). Les cultures pures font l’objet d’une purification sur le même milieu d’isolement.

6 Identification

Les cultures pures obtenues ont fait l’objet de l’identification jusqu’à l’échelle de l’espèce en respectant les étapes suivantes :

6.1 Identification biochimique

6.1.1 Test de fermentation du glucose

Nous avons vérifié le caractère de fermentation du glucose caractéristique des entérobactéries sur le milieu TSI (Triple Sugar Iron). La technique est présentée dans la partie annexe (N°2).

6.1.2 Galerie biochimique

Dans cette étape nous avons procédé à une identification des entérobactéries obtenues en se basant sur leurs caractères biochimiques étudiées par la galerie API 20E. l’incubation, la lecture et l’interprétation des résultats de la galerie API 20E ont été effectués en se référant aux instructions du fabricant. Cette technique est présentée dans la partie annexe (N°3).

6.2 La spectrométrie de masse douce MALDI-TOF MS

La spectrométrie de masse douce MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation, TOF : Time-Of Flight) a été réalisée en utilisant le spectromètre de type Microflex LT (Bruker Daltonics, Brême, Allemagne) en suivant le protocole déjà décrit par (Seng et al., 2009).

6.2.1 Principe

Une des utilisations de la spectrométrie de masse douce à travers les spectromètres tel que le microflexe LT (Bruker Daltonics), est l’identification des micro-organismes à différents niveaux taxonomiques jusqu’à l’échelle de l’espèce.

L’identification est basée sur le spectre de masse des protéines cellulaires du micro-organisme en question qui fera l’objet de comparaison contre les banques de données de spectre des micro-organismes disponibles à l’aide d’un logiciel généralement fourni avec le spectromètre.

Le spectre protéique d’un micro-organisme est le résultat d’un bombardement du dépôt du lysat cellulaire (contenant les protéines cellulaires) recouvert d’une matrice, par un laser. Ce bombardement conduit à la libération des électrons qui vont voler à différentes vitesses tout le long du tunnel du spectromètre. Les temps de vol jusqu’à l’arrivé à la fin du tunnel sont enregistrés et permettent d’exprimer les masses des protéines présentes dans le dépôt sous forme d’un spectre spécifique (empreinte) du micro-organisme en question. Le principe de la spectrométrie de masse douce est illustré dans la figure 12.

Figure 12. Principe de la spectrométrie de massedoucede type MALDI-TOF (Courcol, 2009).

6.2.2 Méthode de réalisation

Avant de réaliser l’analyse, il faut procéder à certaines étapes essentielles commençant par le lavage de la cible, ensuite le dépôt des échantillons et l’introduction de la cible dans le spectromètre.

6.2.2.1 Lavage de la cible

Cette étape consiste en une alternance d’étape de rinçage à l’eau chaude et à l’éthanol à 70% suivie du frottement à l’aide d’un papier fin (dédié). Ensuite la cible est frottée en présence de 500 μl de TFA (Acide TriFlurocetique) à 80%. Finalement la lame doit être rincée à l’eau pure et mise à sécher à l’air libre avant d’être utilisée.

6.2.2.2 Préparation de la matrice

Un mililitre de la matrice doit être préparé d’une solution saturée d’alpha cyano-4- hydroxy-cinnamic acid (HCCA) dans un tube stérile de 1,5 ml contenant 500 μl d’acétonitrile HPLC (High-Performance Liquid Chromatography), 475 μl d’eau HPLC, et 25 μl de TFA (trifluoroacetic acid). Le tube doit être vortexé et fera l’objet d’une sonication pendant 10 minutes dans un bain sonicateur, puis centrifugé 5 minutes à 13000 tours par minute (t pm), le surnageant est transféré dans un autre tube stérile. La matrice est ainsi prête pour l’utilisation, sa conservation doit être dans un tube à 4°C à l’abri de la lumière. La matrice servira aussi comme témoin négatif.

6.2.2.3 Préparation du témoin positif

Le témoin positif s’agit de protéines cellulaires de l’espèce E. coli (DHα50) Bacterial Test Standard (BTS) (#255343, Bruker) lyophilisées dans un tube fourni par le fabriquant auquel on rajoute 500 µl d’une solution contenant 475 µl d’eau HPLC, 25 µl du TFA et 500 µl d’acétonitrile HPLC. Ensuite les tubes sont mélangés et laissés reposer 5 minutes. Le BTS est prêt à l’emploi et peut être conservé en aliquotes de 10 μl pendant 6 mois à - 20°C.

6.2.2.4 Préparation des échantillons pour l’analyse spectrométrique

A partir d'une culture bactérienne de 24 h on prélève les colonies à identifier, et on les dépose sous forme d'un fin frottis, sur les spots de la plaque métallique servant de cible au laser. Pour chaque souche, on applique 4 spots pour réduire le risque d'erreur. Une fois tous les dépôts effectués, on dépose 1,5 μl de matrice sur chaque spot ensuite on laisse sécher pendant 15 minutes pour permettre sa co-cristallisation avec l‘échantillon bactérien.

6.2.2.5 Lecture et interprétation des résultats

Les spectres protéiques spécifiques de chaque isolat obtenu par MALDI-TOF MS seront interrogés devant une base de données locale des spectres protéiques spécifiques des espèces des bactéries disponibles en utilisant un logiciel MALDI Biotyper version 3.1 (Bruker Daltonics). Les résultats de la comparaison des spectres sont exprimés par des scores dont les valeurs déterminent l’échelle de l’identification allant de l’absence de l’identification jusqu’à l’échelle de l’espèce. Les valeurs définissant le niveau de l’identification taxonomique par MALDI-TOF MS sont présentés dans le tableau 5.

Les résultats obtenus peuvent être validés une fois que le T+ et T- sont confirmés comme suit:

- T+ doit correspondre à E. coli avec un score > 1.9. - T- doit correspondre à un score sans identification.

Tableau 5. Interprétation des scores d’identification bactérienne obtenue par MALDI-TOF MS.

Score Description Couleur

1.900…

3.000 ^{Identification de l’espèce Vert}

1.700…

1.899 ^{Identification du genre Jaune}

0.000…

1.699 ^{Aucune identification Rouge}

7 Détermination de la sensibilité aux antibiotiques