2-1 Séchage et préparation de la drogue

Le séchage des échantillons a été réalisé à l’abri de la lumière et à une température ambiante, afin de préserver au maximum l’intégrité des molécules. Ils ont été, ensuite, pesés et broyés à l’aide d’un mortier, pour les futures investigations phytochimiques et biologiques. 1-3-Etude analytique

Les analyses effectuées sont toutes conformes aux normes (AFNOR, 1985). Elles consistent en la détermination de la matière sèche, minérale et organique.

1-3-1- Détermination de la teneur d'humidité

Selon Audigie et al. (1985), on procède à une dessiccation du produit à une température de 103° C ± 2° C dans une étuve jusqu'à l’obtention d’une masse constante. Le taux d'humidité est défini comme la perte de masse subie dans les conditions de la mesure. Elle est exprimée par la relation :

Poids X : Poids de l’échantillon (frais).

Poids Y : Poids de l’échantillon (après séchage). H% : Taux d’humidité exprimé en pourcentage. 1-3-2- Détermination de la teneur en matière sèche

La matière sèche est déterminée à partir d’une masse X de matière végétale introduite dans un creuset taré, puis séchée dans une étuve à 105º C jusqu’à un poids constant. Après refroidissement dans un dessiccateur, le creuset est pesé. Le taux de matière sèche est déterminé par l’équation:

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S : Masse du creuset sorti du dessiccateur moins la tare ; X : Masse de la matière végétale fraiche ;

MS% : Taux de la matière sèche.

1-3-3- Détermination de la teneur en matière minérale

La méthode utilisée est la méthode de minéralisation par calcination. Le taux de la matière minérale est le résidu minéral après destruction de la matière organique par calcination dans un four à une température de 550° C durant 6 heures. Le pourcentage de la matière minérale est donné par la relation suivante :

X : Masse de la prise d’essai.

1-3-4- Détermination de la teneur en matière organique

La teneur de la matière organique est déterminée par la différence entre la matière sèche et la matière minérale (Sauvant, 1988).

1-3-5- Criblage phythochimique

L’examen phytochimique est nécessaire pour identifier les grandes familles de métabolites secondaires existants dans les feuilles et les tiges des plantes étudiées. Il est fondé sur des réactions de coloration ou de précipitation à l’aide de réactifs appropriés. Les essais phytochimiques ont été menés suivant les méthodes décrites par : Paris et al., 1969 ; Rizk, 1982 ; Trease et Evans, 1987 ; Harborne, 2005; Békro et al., 2007 ; N’guessan et al., 2009).

✓ Les composés appartenant au groupe des flavonoïdes ont été mis en évidence par la réaction à la cyanidine.

✓ La caractérisation des tanins a été faite par la réaction au chlorure ferrique. MO% = MS % - MM%

MM% = ((tare + X) - tare) / X. 100 MS(%) = S / X. 100

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✓ La recherche des alcaloïdes a été réalisée à l’aide des réactifs généraux de caractérisation des alcaloïdes (Réactif de Dragendorff, réactif de Mayer et le réactif de Bouchardât).

✓ La recherche des saponosides est basée sur la propriété de mousser les solutions aqueuses.

✓ La présence des anthocyanes a été effectuée par l’ajout de HCl à 2N.

✓ L’ajout de l’ammoniaque dilué à 10% et la fluorescence bleue des tubes sous UV à 366 nm confirme la présence des coumarines.

✓ La détection des composés réducteurs a été faite à l’aide de la liqueur de Fehling. Les résultats sont classés selon l’apparition en :

+++ : Réaction très positive + + : Réaction moyennement positive

+ : Réaction faiblement positive

- : Absence

1-3-5-1- Epuisement du matériel végétal avec de l’eau chaude

Un gramme de matière végétale (tiges, feuilles) est infusé dans 100 ml d’eau distillée bouillante pendant 15min. L’infusé est filtré et l’extrait aqueux est soumis aux tests suivants: 1-3-5-1-1- Caractérisation des saponosides

La détection des saponosides est réalisée en ajoutant 3ml d’eau distillée à 2 ml d’extrait végétal. La solution obtenue est fortement agitée. La formation d’une mousse stable, persistant pendant 20 minutes indique la présence abondante des saponosides (hauteur supérieure à 1 cm).

La teneur en saponosides est évaluée comme suit : ✓ Pas de mousse = test négatif

✓ Mousse moins de 1 cm = test faiblement positif ✓ Mousse de 1-2 cm = test positif

✓ Mousse plus de 2 cm = test très positif. 1-3-5-1-2- Caractérisation des sucres réducteurs

Leurs détection consistent à traité l’extrait avec deux a trois gouttes de la liqueur de Fehling (A+B) (1/1) (voir annexe), l’ensemble est porté à ébullition dans un bain marie pendant 30 min. L’apparition d’un précipité rouge-brique au fond du tube indique la présence de composés réducteurs.

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1-3-5-2- Epuisement du matériel végétal avec un solvant alcoolique 1-3-5-2-1- Caractérisation des tannins

Une quantité de 1,5 g de matériel végétal sec sont placés dans 10 ml de méthanol dilué à 80 %. Après 15 minutes d’agitation, les extraits sont filtrés et mis dans des tubes. L’ajout de FeCl3 à 1 % permet de détecter la présence ou non de tanins. La couleur vire au bleu noir en

présence de tanins galliques et au brun verdâtre en présence de tanins catéchiques (Rizk, 1982). La réaction de Bate-smith a permis de confirmer la présence ou l’absence des tannins condensés ; une coloration rouge signe leurs présences.

1-3-5-2-2- Caractérisation des polyphénols

La réaction au chlorure ferrique (FeCl3) a permis de caractériser les polyphénols selon

le protocol suivant:

Une prise d’échantillon végétal de 0,5 gramme est macérée à la température ambiante dans 15ml d’un mélange hydro- acétonique (acétone – eau) à (60 : 40 v/v), puis filtré a l’aide d’un papier filtre, puis une goutte de solution de chlorure ferrique à 2% est ajouté a l’extrait acétonique. L’apparition d’une coloration bleu-noirâtre ou verte plus ou moins foncée fut le signe de la présence de polyphénols.

1-3-5-2-3- Caractérisation des flavonoïdes (réaction à la cyanidine)

La réaction à la cyanidine à permis la caractisation des flavonoïdes. 5ml d’extrait éthanolique est évaporé à 65° C, pendant 10 min. Le filtrat obtenu a été repris dans 1 ml d’acide chlorhydrique concentré. En ajoutant deux à trois copeaux de magnésium, il y aura un dégagement de chaleur ; une coloration rose rouge cerise, orangé ou rouge violacée marque la présence des flavonols, flavones et les flavonones.

1-3-5-2-4- Caractérisation des alcaloïdes

Un macéré est préparé avec 1g de matière végétale et 3ml d’acide chlorhydrique diluée à 5%. L’ensemble est filtré, puis divisé à trois volumes.

1. Un millilitre de l’extrait est ajouté à deux à trois gouttes de Réactif de Mayer. 2. Un millilitre de l’extrait est ajouté à deux à trois gouttes de Bouchardât. 3. Un millilitre de l’extrait à deux à trois gouttes de Dragondroff.

La présence d’un précipité ou d’une coloration orangée ou brun-rougeâtre, après quelques minutes indique la présence des alcaloïdes.

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1-3-5-2-5- Caractérisation des anthocyanes

Deux millilitres d’infusé aqueux sont ajoutés à 2 ml de HCl à 2N. L’apparition d’une coloration rose- rouge qui vire au bleu violacé par addition d’ammoniac indique la présence d’anthocyanes.

1-3-5-2-6- Caractérisation des coumarines

Une quantité de Cinq millilitres d’extrait végétal est évaporé au bain marie jusqu'à obtention d’un volume de 1ml. Un millilitre d’eau chaude a été ajouté. Les 2 ml obtenus sont devisés dans deux tubes en deux volumes égaux. Dans l’un des tubes, 0,5 ml de NH4OH

dilué à (10%) a été ajouté, l’autre sert de témoin. L’apparition d’une fluorescence bleue sous les rayons UV à 366 nm confirme la présence des coumarines.

1-3-5-2-7- Les huiles essentielles

Grâce a un appareillage de type « Clévenger », l’extraction de l’huile essentielle a été effectuée par hydrodistillation pendant une durée de trois heures pour une quantité de 100g de matière végétale sèche immergée dans 1000 ml d’eau distillée (Clevenger, 1928).

Le liquide obtenue est appelé « distilla » et qui contient deux phase : une phase organique « qui est l’huile essentielle » et une phase aqueuse « eau aromatisée ». Le distilla est versé dans une ampoule de décantation afin d’éliminer la phase aqueuse par différence de densité. L’huile essentielle a été stockée à l’obscurité à 4° C, pour les travaux ultérieurs.