L’étude du site d’appariement du sRNA sur l’ARNm de la cible est essentiel pour comprendre le mécanisme de répression post-transcriptionnel de RyhB sur zapB. La prédiction in silico du site d’appariement sur la plateforme IntaRNA (Mann et al., 2017) a mis en évidence la possibilité de liaison de 11 nucléotides de RyhB (à partir des nucléotides 52 à 62) à la séquence codante de zapB au niveau du dixième codon (entre le nucléotide 119 et 129 du transcrit à partir du +1) mentionné dans la figure 28-a. Cet appariement fort et riche en GC a été confirmé par la cartographie in vitro en utilisant 185 nucléotides du transcrit de zapB radiomarqué en 5’. En effet, la formation du duplex ARN-ARN lors de l’appariement de RyhB protège ce site du clivage des nucléotides par l’acétate de plomb surligné en rouge dans la figure 28-b.
Figure 28 : RyhB s’apparie dans la séquence codante de l’ARNm de zapB in vitro. a) Prédiction de l’appariement de RyhB sur l’ARNm zapB par la plateforme IntaRNA à une température de 37°C. L’énergie libre minimale est de -11,39 kcal/mol (Mann et al., 2017) .b) cartographie du site d’appariement de RyhB sur le transcrit zapB radiomarqué en 5’ UTR en utilisant l’acétate de plomb (PbAc). Le transcrit de zapB représenté par les 185 premiers nucléotides à partir du +1 déterminé (dans la section 3-1). La région d’appariement à RyhB soulignée en rouge d’appariement est protégée des clivages par le PbAc.
Après avoir déterminé l’interaction potentielle in vitro entre RyhB et sa nouvelle cible, il est important de confirmer in vivo ce site d’appariement. Pour cela, j’ai utilisé deux différents mutants de la fusion traductionnelle utilisée précédemment (ZapB51) dans des essais de β-galactosidase pour démontrer que l’effet de RyhB est dû à l’appariement délimité dans la séquence codante de zapB. Dans un premier temps, j’ai voulu exclure toute possibilité que RyhB s’apparie dans la région du RBS et du codon AUG pour agir sur l’initiation de la traduction. Dans ce but, j’ai construit un mutant en remplaçant le promoteur et toute la région
du 5’UTR de zapB par celle du gène contrôle icd dans la fusion icd 5’UTR ZapB51. En se référant à l’absence de l’effet de RyhB sur la traduction du contrôle Icd obtenue précédemment (figure 26), l’effet de RyhB sur le niveau de traduction rapporté dans la fusion traductionnelle du mutant icd 5’UTR ZapB51 nous permet de confirmer que le site d’appariement de RyhB serait bien dans la séquence codante de zapB. Tout comme dans la fusion ZapB51, RyhB réduit de 50% le niveau de traduction du mutant 5’UTR (figure 29-b) sans effet sur le niveau de transcription observé à l’induction endogène de RyhB avec le chélateur de fer DIP (résultats non montré).
Ensuite, j’ai construit un mutant d’appariement de la séquence d’interaction de zapB avec RyhB déterminé par la cartographie. Dans le but d’affaiblir la force d’appariement ou de l’éliminer, j’ai changé des nucléotides de cette séquence (6 sur 11 nucléotides du site d’appariement) afin déstabiliser les ponts d’hydrogène entre cytosine et guanine entre RyhB et zapB. Les mutations sont détaillées dans la représentation de la fusion ZapB51mut dans la partie surlignée en rouge (figure 29-a). Les essais β-galactosidase de cette construction montrent une récupération du taux de traduction en présence de RyhB par rapport au contrôle portant un vecteur vide. Les mutations ont donc permis d’éliminer complètement l’effet de RyhB sur le blocage de la traduction de zapB.
Figure 29 : RyhB s’apparie dans la séquence codante de l’ARNm de zapB in vivo. a) Détails des fusions utilisées pour prouver l’appariement de RyhB dans la séquence codante de
zapB. La fusion icd 5’UTR ZapB51 (NL144-NL147) est composée de la séquence promotrice de la
région 5’UTR du gène contrôle icd (apparait en rouge) et la séquence codante de zapB51 fusionnée au
lacZ dans le même cadre ouvert de lecture. La fusion ZapB51mut (NL238-242) comporte des
mutations dans le site d’appariement de RyhB. Les mutations sont représentées par les flèches vers les nucléotides substitues.b) L'activité du gène zapB a été mesurée par un essai β-galactosidase sur les fusions traductionnelles de ZapB51 et des mutants icd 5’UTR ZapB51 et ZapB51mut. Le test t de
Student a été réalisé sur les données afin déterminer les différences significatives des résultats en absence et en présence de RyhB (ns est annoté en absence de différence significative puis *p<0.05, **p<0.01 et ***p<0.001 selon le degré de significativité).
Les résultats des mutants de zapB confirment l’appariement de RyhB dans la séquence codante au niveau du dixième codon du cadre ouvert de lecture de zapB. Afin de retrouver l’effet de RyhB sur le mutant d’appariement ZapB51mut, j’ai construit un mutant
complémentaire de RyhB aux six mutations de ZapB51mut; cependant les Northen blot d’ARN totaux extraits de la souche portant RyhB mut ont montré qu’il est instable dans la cellule. Il se pourrait que les mutations sur RyhB aient altéré la liaison à Hfq en modifiant les structures secondaires de l’extrémité 3’ de RyhB ce qui rend l’interaction de la chaperonne à RyhB moins accessible, limitant ainsi sa demi-vie.
L’appariement de RyhB sur l’ARNm de zapB dans la séquence codante bien au-delà de la fenêtre des 5 premiers codons décrites par (Bouvier et al., 2008) bloquerait partiellement à 50% la traduction. Ce résultat laisse supposer que Hfq aurait un rôle clé dans le blocage de la traduction. Elle pourrait provoquer un encombrement stérique au niveau de l’initiation de la traduction soit en se liant à zapB proche du site de fixation du ribosome ou par l’appariement de RyhB en complexe avec Hfq ce qui limiterait la stabilité du ribosome. Pour répondre à ces hypothèses, j’ai utilisé des méthodes in vitro pour connaitre le site d’attachement d’Hfq sur l’ARNm zapB et des tests in vivo en utilisant des mutants Hfq pour mieux cerner son rôle dans cette régulation. Les résultats sont résumés dans la prochaine section.