Des tests de β-galactosidase ont été effectués en utilisant la même séquence de la fusion courte précédant en fusion traductionnelle (ZapB51). La séquence codante des 17 premiers codons de zapB est fusionnée dans le même cadre ouvert de lecture du gène lacZ; Ce type de fusion rapporte le niveau de transcription et de traduction. Dans le contexte de cette fusion courte, on se concentre uniquement sur le niveau de traduction de zapB. En effet, la fusion transcriptionnelle contenant les 51 premiers nucléotides de la séquence codante de zapB ne montre aucune dégradation de l’ARNm (Figure 25). Une fusion traductionnelle du gène Icd portant 240 nucléotides de la séquence codante fusionnée au gène lacZ a été utilisée comme contrôle (Figure 26-a). Ce gène, nullement cible de RyhB, est le contrôle interne utilisé en routine au laboratoire.
La mesure de l’activité beta-galactosidase de cette fusion traductionnelle est réduite de 50 % en présence de RyhB en comparaison à la fusion contrôle Icd (Figure 26). Ce résultat nous laisse supposer que RyhB bloquerait la traduction de zapB.
Ces résultats ont été aussi confirmés en utilisant des souches sauvages (EM1055) avec induction avec 200 µM de DIP à une DO 600nm de 0.1 (figure 30-b).
Figure 26 : Effet de RyhB sur les fusions traductionnelles de zapB.
a) Détails des gènes zapB et icd et des constructions des fusions traductionnelle ZapB51-LacZ et
(DL1363-DL1364) Icd-LacZ (KP844-KP845). b) L'activité du gène zapB a été mesurée par un essai β-galactosidase sur les fusions traductionnelles des deux gènes. La présence de RyhB montre une réduction du niveau de traduction de ZapB51-LacZ de 50% en comparaison à une souche portant le
vecteur contrôle. Aucun effet n’a été noté sur l’activité du gène contrôle Icd. Le test t de Student a été réalisé sur les données afin déterminer les différences significatives des résultats en absence et en présence de RyhB (ns est annoté en absence de différence significative puis *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 et ****p<0.0001).
Il serait intéressant par la suite de savoir si la dégradation est active, c’est-à-dire due au recrutement de la RNase E, ou passive de par la perte de protection conférée par les ribosomes en cours de traduction. Pour répondre à cette question, on pourrait utiliser une fusion traductionnelle longue (+242) en ajoutant un codon stop tôt dans la séquence codante afin de mimer l’arrêt de traduction provoqué par l’appariement de RyhB au RBS. Ainsi, l’ARNm se retrouvera dépourvu de ribosomes et donc de leur protection contre les ribonucléases. En comparant les résultats obtenus entre une souche surexprimant RyhB (pBAD-ryhB) ou portant un vecteur vide (pNM12), nous pourrons déterminer si RyhB est requis pour induire la dégradation de zapB via le site distal de clivage. Ainsi, si les tests β-
galactosidase montrent une diminution du taux d’ARNm zapB lors de la surpexpression de RyhB, cette dégradation serait due au recrutement actif du complexe RNase E-dégradosome. Dans le cas où les activités β-galactosidase seraient similaires, la dégradation nucléolytique seraient plutôt passive.
Dans le but de confirmer l’action direct de RyhB sur le blocage de la traduction de zapB et de comprendre l’implication de Hfq dans cette régulation dans des conditions contrôlées, des essais de traduction in vitro ont été entrepris, en présence de chacun des acteurs en concentration équimolaire de RyhB et de Hfq séparément puis de RyhB et Hfq appariés respectivement à l’ARNm zapB afin de comprendre l’effet cumulatif des deux acteurs de régulations. L’ARN lacZ a été utilisé comme contrôle de réaction et a subi le même traitement que le transcrit de zapB.
Selon les résultats de la synthèse in vitro de la protéine ZapB, RyhB et Hfq affecterait la traduction (essais 2-3 figure 27) par comparaison comparant au contrôle de réaction (essai 1). Tous deux contribueraient donc à une réduction de la production de la protéine. L’effet cumulatif observé dans le dernier essai (4), l’appariement de RyhB et ensuite de Hfq sur l’ARN de zapB, semble accentuer l’effet sur le blocage de la traduction par rapport à l’effet individuel de chacun des acteurs de la régulation. La production de la protéine est réduite de 50%. La synthèse de LacZ utilisée comme contrôle de traduction n’est affectée ni par RyhB, ni par Hfq ou la combinaison des deux. Cette expérience a été réalisée 3 fois en obtenant les mêmes résultats.
Figure 27 : Effet de RyhB et de Hfq sur la traduction in vitro de ZapB.
Les réactions équimolaires contenants RyhB (2) et Hfq (3) à une concentration de 4 µM ont été initiées avec la présence du transcrit pleine longueur de zapB. De même que pour le mélange RyhB et Hfq selon la méthode expliquée dans la section II-14. LacZ est le contrôle de la réaction. En dessous de chaque réaction est représenté dans l’histogramme le niveau de la protéine ZapB relative à la réaction contrôle déduit après l’étude de la densitomètrie qui a été calculée à l’aide du logiciel GelQuantNET.
Les données de cette partie de résultats permettent de confirmer l’action directe de RyhB sur l’ARNm de zapB. En effet, RyhB réprime la traduction de zapB que ce soit dans les essais in vivo et in vitro. Son appariement à la cible entraine la déstabilisation de l’ARNm avec blocage partiel de la traduction et va mener à la dégradation par le recrutement de la RNase E et du dégradosome. La déstabilisation est liée au blocage de la traduction. Dans la prochaine section de résultats, je me suis penchée sur les détails de l’appariement de RyhB sur l’ARNm de zapB mais aussi sur le rôle qu’aurait la protéine chaperonne Hfq dans cette régulation.