sécrétrice des cellules PC12
II. C.4. Robustesse du test
Plusieurs paramètres contribuent à l’efficacité et la robustesse d’un test. Nous avons voulu nous assurer que les résultats obtenus avec le test que nous décrivions étaient fiables et peu sensibles à de légères variations de conditions expérimentales.
Ainsi, la qualité du signal (i.e. l’augmentation de capture de [3H]5-HT par expression de SERT) doit idéalement être stable malgré des altérations des conditions de transfection et de charge en [3H]5-HT, notamment.
II.C.4.a. Relative invariance vis-à-vis de la quantité de vecteur codant SERT
De fait, des variations de la quantité de plasmide codant SERT utilisée lors de la transfection n’ont que peu de répercussions sur la capacité d’accumulation de la [3H]5-HT le jour de l’expérimentation (voir Figure 31 et Figure 32) ; une accumulation optimale de [3 H]5-HT est atteinte pour de faibles quantités de vecteur codant SERT (jusqu'à 0,4 µg de vecteur/106 cellules). Cette confortable marge permet ainsi une assez grande liberté pour le choix des quantités des vecteurs codant les protéines d’intérêt, afin d’obtenir des conditions optimales de surexpression.
Figure 31
Evolution de la capacité d’accumulation de cellules PC12 exprimant SERT en fonction de la quantité de vecteur pCMV-rSERT lipofecté. Des quantités variables d’un mélange contenant la même proportion de vecteur pCMV-rSERT et de vecteur vide (pcDNA3) ont été utilisées pour transfecter des cellules PC12 (le ratio ADN/lipofectant étant fixé). Quatre jours après la transfection,
la capacité d’accumulation de [3H]5-HT a été
testée. Un quasi-plateau est observé à partir de 1,6 µg d’ADN total (soit 0,8 µg de vecteur
pCMV-rSERT/106 cellules). C’est cette
dernière condition qui a été retenue pour l’utilisation en routine du test de sécrétion.
Figure 32
Evolution de la quantité totale de [3H]5-HT
capturée en 1 heure lors de variations de la quantité d’ADN SERT utilisée pour la lipofection, dans une gamme balancée pCMV-rSERT/pEGFP (quantité globale
d’ADN fixée à 1,6 µg d’ADN/106 cellules).
La modification du ratio des vecteurs pCMV-rSERT/pEGFP ne modifie que peu la capacité
finale des cellules à accumuler la [3H]5-HT ;
ainsi, le système de transport est rapidement saturant pour de faibles quantités de vecteur codant SERT, assurant ainsi une bonne reproductibilité des expériences. La marge ainsi dégagée permet une grande flexibilité dans le choix des quantités du vecteur codant l’éventuelle protéine d’intérêt pour aboutir à une surexpression optimale. NT : cellules non transfectées. 0 1 2 3 4 5 6 7 0 0,8 1,6 3,2 6,4
ADN total lipofecté (µg/106 cellules)
[ 3H]5-HT totale ac cumulée(pmole/10 6 cells ) 0 1 2 3 4 5 6 7
0% SERT 25% SERT 50% SERT 75% SERT NT
[ 3H]5-HT to tale accum u lée (pmole/1 0 6 cells )
II.C.4.b. Relative invariance vis-à-vis de la concentration extracellulaire en [3H]5-HT
La concentration usuelle de [3H]5-HT extracellulaire adoptée au moment de la charge (~100 nM) est dans une gamme bien inférieure au Km de SERT pour la 5-HT (~10 µM). Néanmoins, une très large gamme de concentrations de [3H]5-HT ( de 10 nM à 10 µM) a pu être balayée sans affecter sensiblement les capacités sécrétrices des cellules (voir Figure 33).
Figure 33
Influence des variations de la concentration de
[3H]5-HT extracellulaire lors de la charge sur
l’activité sécrétrice des cellules PC12 surexprimant SERT. Les cellules ont été chargées (1h, 37°C) en présence de concentrations variables de 5-HT (non marquée
isotopiquement) additionnée de [3H]5-HT à
dose traçante (10 nM). Après lavages et chasse d’une heure, la capacité sécrétrice des cellules a été déterminée par stimulation de l’exocytose par une solution dépolarisante (10 min, 55 mM
K+). L’activité sécrétrice exprimée est la
fraction libérée de la [3H]5-HT totale contenue
dans les cellules à l’issue de la chasse.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0,00 0,01 0,10 1,00 10,00 100,00 [5-HT]ext (µM) Sé cr étio n ( % d e la [ 3H] 5-HT c ellul ai re t o ta le )
II.C.4.c. Relative invariance vis-à-vis du temps de capture de [3H]5-HT
Nous avons vu précédemment que la quantité totale de [3H]5-HT accumulée par les cellules surexprimant SERT croit (jusqu'à ~1h) puis décroît régulièrement au cours du temps. Nous nous sommes assurés que l’activité sécrétrice était indépendante de la charge totale des cellules en [3H]5-HT en réalisant des captures de durée variable, suivies de lavages et d’une chasse de durée fixe (1 h). À l’issue de la chasse, la capacité sécrétrice des cellules a été mesurée (55 mM K+, 10 min, voir Figure 34 et Figure 35).
Figure 34
Evolution de l’accumulation
cellulaire totale de [3H]5-HT en
fonction du temps de charge. Après un temps variable de charge, les cellules ont été brièvement rincées, et la radioactivité totale mesurée après une chasse additionnelle d’une heure en
l’absence de [3H]5-HT. Comme
précédemment décrit, la quantité de
[3H]5-HT capturée croît pour des
temps de capture jusqu’à une heure, puis décroît lentement en fonction du temps. 0 1 2 3 4 5 6 15 30 60 180
Temps de charge en [3H]5-HT (min)
[ 3H] 5-H T tot al e ac cu mu lée (pm ole /10 6 cell s)
Figure 35
Détermination de la capacité
sécrétrice en [3H]5-HT après un temps
variable de charge (voir légende de la figure précédente). La quantité libérée
de [3H]5-HT en 10 minutes (55 mM
K+) est rapportée à la quantité totale
dans les cellules. Malgré les variations
de la charge totale en [3H]5-HT au
cours du temps, la fraction libérée demeure constante. 0 5 10 15 15 30 60 180
Temps de charge en [3H]5-HT (min)
Séc rét io n (% d e la [ 3H] 5-H T c el lu la ir e tot al e)
II.C.5. Conclusions – Avantages du test de mesure de l’activité
sécrétrice basé sur la co-expression de SERT
L’étude des mécanismes sous-tendant la sécrétion régulée des hormones et des NT nécessite souvent la perturbation de ces mécanismes par la surexpression, dans des modèles cellulaires variés, de protéines exogènes sous leurs formes sauvages ou mutantes. La lignée PC12 est un modèle cellulaire souvent utilisé pour ces études. La plupart des techniques disponibles pour l’étude de l’activité sécrétoire, et la détermination de l’impact éventuel de protéines étudiées, nécessite souvent des savoir-faire et des appareillages complexes, comme dans le cas des mesures électrophysiologiques sur des cellules isolées. L’investissement humain et financier nécessité par ce type d’approche, ainsi que la complexité des méthodes, les rendent difficilement accessibles pour des laboratoires non spécialisés. Il existe donc un réel besoin de méthodologies simples, rapides à mettre en œuvre et peu coûteuses pour tester l’impact éventuel d’une protéine sur le processus sécrétoire. C’est dans ce but que la technique populaire de co-expression de la hGH dans les cellules PC12 (et également les cellules chromaffines) fut élaborée il y a une dizaine d’années (Wick et al., 1993). Cette technique possède a priori l’essentiel des critères nécessaires à la détection rapide d’un effet d’une protéine donnée sur la sécrétion, mais pour les raisons évoquées précédemment dans ce chapitre, il nous semblait intéressant de rechercher d’autres moyens, plus reproductibles et moins coûteux, d’arriver à ce résultat dans les cellules PC12.
Les données présentées dans notre étude montrent que la technique développée par nos soins présente de nombreux avantages. D’une part, l’activité utilisée comme rapporteur est une activité physiologique de ces cellules (accumulation et libération de monoamines). D’autre part, l’activité reportrice est virtuellement indépendante de la concentration de [3 H]5-HT dans le test, du temps de charge, et peu dépendante de faibles variations du taux d'expression de SERT. Par ailleurs, la technique de mesure de la [3H]5-HT (comptage des émissions β par scintillation liquide) est sensible, précise et non saturable. Un avantage supplémentaire de cette approche est la possibilité de mener des études à la fois au niveau d’une population entière (charge en [3H]5-HT) et également par caractérisation de l’activité sécrétrice de cellules isolées (charge en 5-HT "froide", cette molécule étant oxydable donc détectable par analyse ampérométrique), réduisant ainsi les biais inhérents aux comparaisons de données acquises dans des systèmes biologiques différents. L’aspect économique du test est également avantageux, dans la mesure où la "matière première" (la [3H]5-HT) est un produit commercialement disponible à un prix réduit. Le seul appareillage important nécessaire à la conduite du test (un compteur β à scintillation) est disponible dans la quasi-totalité des instituts de biologie. À titre indicatif, le coût d’un point de mesure est environ 15 à 20 fois moindre que dans le test de sécrétion de la hGH. Nous avons donc par la suite adopté cette technique de mesure de l’activité sécrétrice au niveau des populations de PC12 comme technique principale.