II.B.1. Contexte de l’étude - Bref historique
Au cours de ma seconde année de thèse, des observations concernant la faible activité de transport de la sérotonine (5-HT) dans les cellules PC12 m’ont amené à m’intéresser aux effets de la surexpression transitoire de SERT (SERotonin plasma membrane Transporter, le transporteur plasmique de recapture de la 5-HT) dans ces cellules ; initialement, les mesures de l'effet d'une protéine d'intérêt sur la sécrétion se faisaient au laboratoire par 2 techniques complémentaires, l'ampérométrie à fibre de carbone et les tests au niveau de populations entières avec la technique décrite par le groupe de Holz (Wick et al., 1993) ; cette méthode est basée sur la co-transfection de vecteurs codant, d’une part, la protéine d’étude, et d’autre part l’hormone de croissance humaine (hGH, human growth hormone). Plusieurs études, ainsi que nos propres observations, montrent en effet que lors de l’utilisation de 2 vecteurs durant le processus de transfection, la grande majorité (>95%) des cellules transfectées reçoivent les 2
constructions. Cette approche permet une mesure sélective de l'activité sécrétrice de la sous-population de cellules transfectées, qui représente usuellement 10-20% de la sous-population totale.
Le rapporteur utilisé ici (hGH) n’est pas présent dans les cellules naïves, et cette hormone est correctement exprimée dans ces cellules qui la stockent dans leurs GS. Il est ainsi relativement aisé de récupérer le surnageant des cellules après stimulation de la sécrétion (par une solution à [K+] élevée, par exemple), de préparer un lysat des cellules et de doser indépendamment la hGH présente dans chaque échantillon (surnageant et cellules) ; la technique utilisée au laboratoire (ELISA) pour ce dosage est basée sur une immuno-adsorption de la hGH par des anticorps dirigés contre elle suivie d’une réaction enzymatique produisant un produit coloré. L’intensité de coloration, proportionnelle dans une certaine limite à la quantité de hGH, est mesurable par spectrophotométrie.
Ce test a été largement utilisé pour l’étude des mécanismes de la sécrétion régulée dans les cellules PC12 et chromaffines. Cependant, certaines difficultés rendent l’utilisation de cette technique délicate. En premier lieu, des problèmes de reproductibilité de la quantité totale d’hormone synthétisée sont couramment rencontrés, malgré des efforts de standardisation des conditions de culture et de transfection ; cette hétérogénéité pourrait sembler anecdotique puisque, dans des conditions contrôles (co-transfection de la hGH avec un vecteur vide, par exemple), la proportion de hGH libérée lors d’une stimulation classique (10 minutes de dépolarisation par 55 mM K+) est relativement constante (~15-20% typiquement). En réalité, si la fraction libérée est certes à peu près invariante dans les contrôles, la quantité totale de hGH exprimée est beaucoup plus variable, en particulier lors de la surexpression simultanée de diverses protéines d’intérêt.
Ceci entraîne une complication technique liée à la nature de la technique de détection de la hGH, i.e. par une réaction enzymatique colorée, qui n’offre une linéarité de réponse que pour des quantités limitées d’hormone.
La saturabilité de la réponse du test colorimétrique, ainsi que la forte hétérogénéité des niveaux totaux de hGH lors de la surexpression des protéines d’intérêt, conduisent fréquemment à devoir effectuer des mesures supplémentaires des échantillons hors de la zone de réponse linéaire. Outre un alourdissement considérable du protocole, la multiplication des
points de mesure pour chaque échantillon devient problématique si l’on considère le coût élevé des réactifs nécessaires au dosage de la hGH. Un autre problème, compromettant la validité du test en tant qu'outil de mesure de la sécrétion, peut être rencontré si la protéine d'intérêt interfère avec le trafic de la hGH ou bien la biogenèse des granules sécrétoires.
Dans le but de minimiser les risques de devoir effectuer plusieurs déterminations de la quantité de hGH pour de nombreux échantillons, nous avons cherché à caractériser, avant le dosage de hGH, l’activité sécrétrice des cellules (l’ensemble de la population) par un test simple, permettant par exemple d’estimer au préalable plus finement la quantité de cellules disponibles et le niveau de leur sécrétion le jour de l’expérience. Pour ce faire, une partie des cellules co-transfectées par la hGH étaient chargées en présence de sérotonine tritiée ([3 H]5-HT), puis leur capacité sécrétoire globale en réponse à une stimulation était estimée par détermination des quantités libérées et restantes de [3H]5-HT dans les cellules. Les informations obtenues (quantité totale de [3H]5-HT accumulée et proportion libérée) permettaient d’anticiper les conditions de dilutions des échantillons à utiliser lors du dosage de la hGH. SERT Na+, 5-HT+, Cl -K+, Face cytoplasmique Face extracellulaire Figure 16
Couplage ionique du transport de la 5-HT par SERT
aux transports de Cl-, Na+ et K+.
La sérotonine est transportée sous sa forme
cationique, en couplage avec l’entrée d’un ion Na+ et
Cl- et de l’extrusion d’un ion K+, suivant leurs
gradients électrochimiques respectifs. Le bilan ionique net du transport est neutre.
II.B.2. Les cellules PC12 sont dépourvues de transport efficace
de la 5-HT
Dans nos conditions de culture, et au moins avec le clone de PC12 en notre possession, les niveaux de charge en [3H]5-HT par les cellules sont faibles (4,0 + 0,3 fmol/min/106 cellules, n=11, mesure réalisée pour des temps courts de capture (<30 min) où celle-ci croit de manière linéaire). Bruno Gasnier, appartenant à une autre équipe du laboratoire et spécialiste des transporteurs vésiculaires de neurotransmetteurs, nous suggéra
d’augmenter cette capacité d’accumulation en exprimant SERT, le transporteur plasmique de recapture de la 5-HT, dans ces cellules.
De fait, les expériences préliminaires montrèrent une importante augmentation de la capture de [3H]5-HT après transfection transitoire de SERT dans ces cellules. Il nous apparut rapidement qu’il était possible de tirer profit de cette observation pour déterminer spécifiquement l’activité sécrétrice de la sous-population ainsi transfectée, plutôt que d’utiliser la mesure de la sécrétion de la hGH. Une part importante de mon travail dans les mois qui suivirent fut employée à mettre au point et à valider ce test. Au cours de ce travail, j’ai été amené à m’intéresser à certains aspects liant la surexpression des transporteurs plasmiques des monoamines à la régulation de la taille quantique.
II.B.3. L’expression de SERT induit une considérable
accumulation de [
3H]5-HT dans les PC12
L’augmentation de l’accumulation de [3H]5-HT présentée sur la Figure 17, déjà considérable en valeur absolue, est en fait encore plus considérable si l’on considère que seule une minorité de cellules transfectées y contribue. Dans les conditions usuelles de transfection utilisées dans cette étude, ~10 à 20 % des cellules PC12 expriment la GFP utilisée comme rapporteur de l’efficacité de transfection. Ceci implique qu’une cellule exprimant effectivement SERT possède une capacité d’accumulation de la 5-HT 100 à 200 fois supérieure à une cellule non transfectée. L’effet d’augmentation de la capture de 5-HT est détectable dès 24 heures après la transfection, puis croît régulièrement jusqu’à 4-5 jours post-transfection.
Time (min) 0 50 100 150 200 250 300 [ 3 H] 5-HT uptake (pmol/10 6 ce lls) 0 2 4 6