Rinçage des protéines adsorbées

Pour augmenter l’efficacité du rinçage, nous avons choisi de mettre en oeuvre une solution saline, couramment utilisée pour la solubilisation des protéines, contenant un surfactant susceptible de favoriser la désorption de la surface. Ces considérations nous ont amenés à utiliser un rinçage identique à celui pratiqué en fin de greffage. Plus particulièrement, après exposition à la solution 1 mg.mL−1 de BSA, les différentes surfaces ont subi le rinçage suivant :

– 5 minutes dans une solution à 0.1% de SDS dans du PBS 1X. – 1 minute dans du PBS 0,2X.

– 1 minute dans du PBS 0,1X.

Caractérisation par spectroscopie infrarouge

La figure 4.8 montre la zone des pics amides I et II des spectres infrarouge après exposition à la solution de BSA d’une surface décylée (a) et d’une surface fonc- tionnalisée par C₅(EG)₁₆OMe et rincée après greffage dans les conditions optimales décrites précédemment. Le spectre (b) est obtenu après le rinçage simple PBS/eau décrit dans la section 4.2.1, tandis que le spectre (c) est obtenu après le rinçage dans la solution PBS/SDS. Le rinçage final modifié ôte toute trace de protéines adsorbées dans ce spectre infrarouge.

Figure 4.8 – Spectres infrarouge dans la zone des pics amides, après immersion dans la solution de BSA, d’une surface greffée avec des molécules C₅(EG)₁₆OMe et rincée de manière optimale après greffage. Un rinçage PBS/SDS après exposition à la BSA (c) permet de retirer toute trace de protéines adsorbées, alors qu’un simple rinçage PBS (b) laisse une faible concentration. Le spectre (a) montre, à titre de comparaison, une surface greffée avec des chaînes décyles qui, indépendemment du rinçage après exposition à la BSA, retient une forte quantité de protéines adsorbées.

En revanche, sur une surface greffée avec des couches décyles, ce rinçage PBS/SDS n’a aucun effet sur la quantité de BSA détectée par infrarouge. Cela montre que dans ce cas, les protéines sont beaucoup plus fortement adsorbées à la surface.

Le même rinçage effectué après exposition à la BSA de couches greffées avec des molécules C_p(EG)_nOMe présentant un rapport n/p plus faible diminue aussi notablement la quantité de protéines qui restent adsorbées en surface, sans toutefois la ramener complètement à zéro.

Les tableaux 4.2, 4.3 et 4.4 montrent les valeurs obtenues pour la quantité de BSA adsorbée sur des surfaces fonctionnalisées par C₅(EG)₁₆OMe, C₅(EG)₁₂OMe et C11(EG)16OMe respectivement, et ayant subi les rinçages standard (toluène, éthanol

puis dichlorométhane seulement) ou optimisé (avec le rinçage PBS/SDS complémen- taire) après greffage, et les rinçages PBS ou PBS/SDS après exposition à la BSA.

C₅(EG)₁₆OMe rinçage après protéine

PBS PBS/SDS

rinçage après greffage standard 0.25 0.12

optimisé 0.05 0

Table 4.2 – Quantité relative de BSA sur une surface fonctionnalisée par C5(EG)16OMe avec différents rinçages.

C5(EG)12OMe rinçage après protéine

PBS PBS/SDS

rinçage après greffage standard 0.35 0.25

optimisé 0.20 0.05

Table 4.3 – Quantité relative de BSA sur une surface fonctionnalisée par C5(EG)12OMe avec différents rinçages.

C11(EG)16OMe rinçage après protéine

PBS PBS/SDS

rinçage après greffage standard 0.50 0.35

optimisé 0.35 0.20

Table 4.4 – Quantité relative de BSA sur une surface fonctionnalisée par C₁₁(EG)₁₆OMe avec différents rinçages.

Les taux de greffage obtenus pour ces 3 molécules sont très voisins (environ 1,1.1014cm−2, voir tableau 3.1). Ainsi, les différences constatées sont principalement attribuables à la nature chimique de la molécule greffée. Le gain obtenu par le rinçage optimisé après greffage s’avère moins spectaculaire que sur les couches C5(EG)16OMe

pour des couches Cp(EG)nOMe présentant un rapport n/p plus faible. Ainsi, un

rinçage optimisé après greffage permet de réduire la quantité de protéines adsorbées de 35% à 20% pour des couches C5(EG)12OMe et de 50% à 35% pour des couches

C₁₁(EG)₁₆OMe. Ceci confirme la capacité intrinsèque des couches C₅(EG)₁₆OMe à limiter l’adsorption non spécifique et que les résidus de greffage présents sur la surface après le rinçage standard sont le facteur le plus limitant pour ces couches.

Caractérisation par microscopie à force atomique

La figure 4.9 montre les images AFM de surfaces greffées avec C5(EG)16OMe

après immersion dans une solution 1 mg.mL−1 de BSA. L’image (a) montre une surface ayant été rincée 10 secondes dans la PBS 1X comme celles de la section 4.2.4, tandis que l’image (b) montre une surface ayant été rincée dans la solution PBS/SDS.

Figure 4.9 – Images AFM de surfaces greffées avec C5(EG)16OMe. Les deux surfaces

ont été rincées dans la solution saline de SDS avant le passage dans la solution de BSA. L’image (a) montre la surface après rinçage PBS et l’image (b) la surface ayant reçu le rinçage PBS/SDS.

Les deux images permettent de discerner facilement la structure en marches d’es- calier du substrat greffé. On peut tout de même remarquer une diminution sensible de la quantité de protéines observée sur la surface ayant rincé dans la solution PBS/SDS, ce qui est cohérent avec les conclusions de l’étude par spectroscopie infrarouge. Tou- tefois, même l’image (b), obtenue pour les meilleurs rinçages à toutes les étapes, n’est pas exempte de traînées témoignant la présence de protéines. Il est vraisem- blable que la qualité de la surface soit meilleure que le rendu de l’image, car si une protéine ou un petit amas de protéines est entraîné par la pointe lors du balayage, cet amas n’est pas toujours abandonné facilement en fin de ligne, et son effet sur l’image peut se prolonger sur plusieurs lignes successives. De ce point de vue, il aurait été intéressant d’imager les surfaces en mode "non contact", moins sensible à ce genre de perturbations.

Afin de tester la stabilité dans le temps de cette capacité des surfaces greffées avec des C5(EG)16OMe à résister à l’adsorption non spécifique des protéines, nous avons

aussi réalisé des tests d’adsorption de BSA après 5 et 15 jours. A chaque fois, les spectres infrarouge des surfaces fonctionnalisées par des C₅(EG)₁₆OMe ne présentait aucun pic amide après rinçage. Ces couches moléculaires ont donc des propriétés de biorésistance stables dans le temps, contrairement à celles obtenues par greffage de H(EG)nOMe.

En conclusion, les couches greffées avec des molécules C_p(EG)_nOMe ont une faible propension intrinsèque à adsorber une protéines comme la BSA. Toutefois, il est important pour conserver cette faculté de contrôler l’agencement de la couche au niveau moléculaire, de petits défauts ou agrégats présents après le greffage pouvant agir comme des points d’ancrage pour l’adsorption non spécifique des protéines. De la même façon, des procédures de rinçage suffisamment énergiques peuvent s’avérer nécessaires pour désorber des protéines faiblement ancrées à la couche moléculaire.

Lorsque tous ces facteurs sont pris en considération, il apparaît toutefois que, comme on pouvait s’y attendre, les molécules présentant un fort rapport n/p sont celles ayant la propension la plus faible à adsorber les protéines. Dans le cas de la BSA, une couche moléculaire formée en greffant des molécules C₅(EG)₁₆OMe s’avère quasi idéale, n’adsorbant qu’une quantité de BSA inférieure au seuil de détection infrarouge et offrant une parfaite stabilité dans le temps.