Les méthodes de modélisation moléculaire sont par nature basées sur l’étude des représentations virtuelles d’entités chimiques et biologiques. Le but principal de l’utilisation de ces méthodes, dans le cadre de cette étude, est d’acquérir un aperçu des événements qui se produisent à l’échelle macroscopique, et qui sont observables par le biais d’études expérimentales. Les analyses des trajectoires DM obtenues ont été menées en deux parties. La première partie visait à valider rigoureusement l’ensemble de nos modèles de conformères KV7.1 par rapport aux données expérimentales afin de s’assurer de la précision des prédictions que l’in prévoyait d’effectuer par la suite (Chapter III.1). Dans un premier temps, nous avons évalué la présence et la stabilité des interactions protéine-protéine de KV7.1, qui incluent les ponts salins états-dépendants ayant été préalablement identifiés par des mutagénèses « à inversion de charge », ainsi que des paires de résidus voisins identifiés par des doubles mutagénèses dirigées, à travers chacune de nos trajectoires DM (Chapter III.1.1). Pour les systèmes DM qui contiennent des sous-unités KV7.1 et KCNE1, nous avons également testé la présence et la stabilité de 20 paires supplémentaires de résidus voisins, extraits de diverses études de mutagénèse dirigée. Nos modèles de canal KV7.1, en absence et en présence de KCNE1, sont tous en accord avec les données expérimentales. Nous avons aussi analysé la présence et la stabilité des interactions protéine-lipide en se focalisant sur les sites d’interaction à PIP2
qui sont localisés sur les sous-unités KV7.1 et KCNE1, respectivement (Chapter III.1.2). Les résultats obtenus pour le système DM qui contient huit molécules de PIP2 satisfait mieux les résultats expérimentaux que les systèmes qui n’en contiennent que quatre, localisés sur les sites d’interaction aux sous-unités KV7.1. D’autres résultats de validation (Chapter III.1.3-4) témoignent également, dans une moindre mesure, de la robustesse de nos modèles du canal KV7.1.
Les résultats que nous avons obtenus à partir de la seconde partie des analyses de trajectoires DM des modèles KV7.1 (Chapter III.2) ont été validés par des études expérimentales menées par nos collaborateurs (Pr. Jianmin Cui et son équipe de recherche) de l’université Washington de Saint-Louis aux Etats-Unis (Chapter III.2.1).
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Les résultats issus des études expérimentales et computationnelles menées sur le canal KV7.1 en l’absence de KCNE1 indiquent que les mécanismes de couplage des états IO et AO du canal sont régis par une interface d’interactions intra sous-unité et état-indépendantes entre S4-S5LINKER et S6, ainsi qu’une seconde interface état-dépendante entre les segments S4, S4-S5L d’une sous unité KV7.1 et les segments S5 et S6 d’une sous unité adjacente. Ces interfaces nous ont permis de prédire un modèle de mécanisme de couplage VSD-PD pour le canal KV7.1 lorsque le VSD atteint ses états intermédiaire et activé. Nous avons conceptualisé nos résultats en un modèle appelé “main-et-coude”. D’autres analyses, focalisées sur les trajectoires DM obtenues pour les modèles du canal KV7.1 en présence de quatre sous-unités auxiliaires KCNE1 et de 8 molécules de PIP2
(Chapter III.2.2), ont mis en évidence la manière dont KCNE1 perturbe le mécanisme “main-et-coude“, apportant des élément permettant d’expliquer les nombreux résultats expérimentaux qui montrent que KCNE1 réduit drastiquement la conductance de KV7.1 au états RC et IO tout en augmentant celle de l’état AO de manière significative.
L’analyse conformationnelle du motif SFF, situé au milieu du segment S6 (Chapter III.2.3) a mis en évidence les différences d’orientation des chaines latérales du résidu F340 entre les modèles fermés et les modèles ouverts. En effet, deux conformations qui semblent dépendre de la conformation ouverte ou fermée du pore ont été observées. Les chaines latérales de F340 sont orientées vers le centre du pore (modèles RC, IC AC), fermant ce dernier lorsque le canal est découplé ou partiellement couplé. Lorsque le canal est couplé (modèles IO, AO), les chaînes latérales de F340 s’orientent en direction tangente à la surface du pore, ou en direction du milieu du segment S5, laissant de l’espace aux ions de diffuser à travers le pore du canal KV7.1.
Les analyses destinées à valider nos modèles ont montré que les interactions protéine-protéine et protéine-protéine-lipide des modèles de complexes KV7.1+KCNE1 sont plus stables en présence de 8 molécules de PIP2 qu’avec 4 seulement. Les résultats obtenus permettent de comprendre à quel point la présence du site d’interaction à PIP2 localisé sur KCNE1 est nécessaire à la stabilité du complexe. En effet, sur les modèles RC et IC, on constate que KCNE1 est également capable de se lier à PIP2 via son site d’interaction, mais également via le site d’interaction à KV7.1, ce qui peut lui permettre de modifier la conformation des segments S6 au niveau de la face interne de la bicouche lipidique (Chapter III.2.4.).
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Dans l’ensemble, ces résultats satisfaisants nous ont permis de prédire les changements conformationnels inhérents aux mécanismes de couplage VSD-PD du canal KV7.1, et ceux du mécanisme d’ouverture du pore, et ce à l’échelle moléculaire. A partir de ces prédictions, nous avons également pu apprécier les effets de KCNE1 et de PIP2 sur ces changements conformationnels.
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Molecular modeling methods are, by nature, based upon the study of virtual representations of chemical and biochemical entities. The main goal of using these computational methods, in the frame of this study, is to gain an atomistic insight of the macroscopic phenomena that were unraveled by experimental studies. The analyses of resulting MD trajectories were conducted in two parts. The first part aimed at thoroughly validating all our models of KV7.1 against experimental data to ensure accuracy (Chapter III.1). First, we determined the presence and the stability of KV7.1 state-dependent protein-protein salt bridges previously identified by charge reversal mutagenesis, as well as the presence of pairs of protein-protein neighbor residues, extracted from both Cys scanning experiments and double mutant cycle analyses were monitored throughout our MD trajectories (Chapter III.1.1). For the MD systems that contain both KV7.1 and KCNE1 subunits, we investigated twenty additional neighbor residue pairs between KV7.1 and KCNE1 residues that we obtained from various mutagenesis studies. Regarding the state-dependent protein-protein interactions within KV7.1 on one hand, and between KV7.1 and KCNE1 on another hand, our models are fully satisfying experimental data. We also addressed the presence and the stability of protein-lipid interactions by analyzing PIP2 binding sites on both KV7.1 and KCNE1 subunits (Chapter III.1.2). We have monitored the distance between charge moieties of the KV7.1 and KCNE1 basic residues and those of PIP2 lipids. The results obtained with the MD systems that contain 8 PIP2 molecules are also in good agreement with experimental data. Additional validation results (Chapter III.1.3-4) were also confirming, in a lesser extent, the robustness of our KV7.1 models.
The results we obtained from the second part of analysis of KV7.1 MD trajectories (Chapter III.2) were validated by functional studies of KV7.1 channel conducted by our collaborators (Pr. Jianmin Cui and colleagues) from Washington University of Saint-Louis in the US (Chapter III.2.1). Computational and experimental results both indicate that the Kv7.1 VSD-PD coupling in both IO and AO states is mediated by an interface of state-independent intrasubunit interactions between S4-S5L and S6, as well as a second interface of state dependent intersubunit interactions between S4, S4-S5L and PD segments, in the absence of KCNE1.
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These interfaces allowed us to predict a model of VSD-PD coupling mechanism for KV7.1 channel when the VSD reaches its intermediate and activated states. We conceptualize all of our findings in this study into a “hand-and-elbow” gating mechanism for voltage-dependent activation of KV7.1 channel. Further analyses, focused on the MD trajectories of systems containing the KV7.1 tetramer (Chapter III.2.2), four KCNE1 subunits, and two PIP2 molecules per KV7.1 monomer, highlighted how KCNE1 disrupts the “hand-and-elbow model” of the VSD-PD coupling we previously designed for KV7.1 channel, providing hints allowing to explain the numerous experimental results that pointed out that KCNE1 reduces drastically the ionic conductance of KV7.1 channel in RC and IO states, while increasing it when KV7.1 VSD is in its activated state.
The conformational analysis of SFF motif, located in the middle of S6 segment (Chapter III.2.3) shed light on the differences of F340 sidechain conformation between the MD trajectories of closed state models and open state models. Indeed, we found 2 distinct conformations that seem to depend on the coupling state of the channel. F340 sidechains adopts the inside conformation, which closes the pore when the channel is uncoupled or partially coupled (RC, AC, IC models). When the channel is coupled (IO, AO models) F340 sidechains adopt the outside conformation, as they are oriented tangent to the pore or towards S5 segment, leaving space for potassium ions to enter the gate.
The analysis of protein-protein and protein-lipid electrostatic interactions in the MD systems containing both KV7.1 and KCNE1 showed that S2-S4 salt-bridges, as well as the protein-lipid interactions, both turned out to be more stable with 8PIP2 molecules due to the presence of an additional PIP2 lipid placed in the KCNE1 binding site previously identified by our collaborators. In addition, the protein-lipid interactions we found in presence of 8PIP2 molecules shed light on the fact that KCNE1 is able to bind the PIP2 lipid located in its own binding site, as well as the lipid located in KV7.1 binding site in both RC and IC models (Chapter III.2.4). These specific interactions between KCNE1 and PIP2
might influence the conformation of the pore in both states.
Altogether, these results allowed us to predict a molecular scale mechanisms of VSD-PD coupling and pore opening, along with the effects of PIP2 and KCNE1 on these mechanisms.
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