3 - RESULTATS - DISCUSSION - Comptage cell ul ai re

Comptage cell ul ai re

3 - RESULTATS - DISCUSSION

3 -1 FABRICATION DE DIFFERENTES SOUCHES D'HYBRIDOMES

Nous avons établi 3 souches stabilisées d'hybridomes sécrétant respectivement les anticorps monoclonaux suivants:

- anti_~1 antitrypsine humaine (tAT) - anti

j3

lactoglobuline bovine (B lac)

- anti Hormone lactogène placentaire humaine.

La souche anti

d-.1

antitrypsine a été détruite quelques mois après sa stabilisation à cause d'une contamination mycoplasmique qui nous a obligé à éliminer toutes nos cellules stockées en azote liquide. Nous n'avons donc pas pu exploiter cet hybridome.

La souche anti B lactoglobuline a permis à un chercheur de notre laboratoire (Madame F. MATI) de travailler sur les récepteurs de cette protéine et d'en étudier les épitopes.

La souche anti-hormone lactogène placentaire a été utilisée par un chercheur (Monsieur H. MAAZOUZI) pour mesurer l'activité facteur de croissance de cette protéine et d'en étudier les épitopes et le mécanisme d'action.

Nous travaillons toujours sur ces lignées pour effectuer des études du métabolisme cellulaire ainsi que des essais de détoxification du milieu de culture (diminution du taux d'ammoniaque) en bioréacteur, en vue d'optimiser la production d'AcMe.

3 - 1 -1 Fabrication d'hybridomes anti 1 antitrypsine

6 souris femelles Balb C ont été immunisées à 3 semaines d'intervalle par 250 ug d'

0\

1 antitrypsine en présence d'adjuvant complet de Freund (ACF).

- 2 mois après la dernière injection, le taux d'anticorps des différentes souris a été contrôlé après prélèvement sanguin.3 nouveaux rappels de 300

)-Ig sont alors réalisés sur la souris la mieux immunisée en présence d'adjuvant incomplet (IFA).

- Le lendemain du 3ème rappel, la fusion des lymphocytes de la rate a été réalisée avec des cellules de myélomes dans un rapport d'une cellule de myélome pour 10 lymphocytes. Les cellules ont été distribuées à raison de 2,8.105 cellules par puits dans 10 plaques de 96 puits en présence de macrophages.

- Après 9 jours, 18% des puits présentaient un ou plusieurs clones.

- Au premier test ELISA, 40 % de ces puits testés donnaient une 0.0.

supérieure à 0,3.

- Les cellules des 16 puits les plus positifs ont été clonées.

- A l'observation microscopique, 430 puits issus de ces clonages présentaient un ou deux clones (28 %). Après le test ELISA n° 2, 275 d'entre eux (64 %) avaient une 0.0. > 0,200.

- Les 8 puits les plus sécrétants ont été alors sélectionnés et 8 nouveaux clonages ont été réalisés. Après lecture de ces clonages et repérage des puits présentant cette fois un seul clone, le test ELISA n03 donnait 72,5 %de puits ayant une 0.0> 0,2.

- Les 5 puits les plus sécrétants ont été sélectionnés et 5 nouveaux clonages nous ont alors permis d'obtenir 75 puits monoclonaux dont les 0.0.

étaient comprises entre 1,5 et 2.

Parallèlement à chaque clonage, les cellules ont été sauvegardées par congélation et après le 3ème et le 4ème test ELISA, des injections de cellules à des souris ont été effectuées afin d'obtenir des liquides d'ascite.

Les différentes étapes de cette manipulation sont résumées dans le tableau 20 (Toutes les 0.0. exprimées, le sont toujours déduction faite, du témoin négatif).

131

-congélation

Congélation des 20 plus sécrétants Congélation

~

960 puits

172 puits présentant 1 prolifération cellulaire

~

(18 %)

ELISA 1 sur les 172 puits

+

~r---~

Congélation clonage n01 sur les 16 puits les plus sécrétants

S ^° ^.

~

ELI A n 2 sur 430 pUits presentant 1 ou 2 clones clonage n° 2 sur les

~

8 puits les plus sécrétants

~

ELISA n° 3

~---~l~---·

Passage en ascite du clonage n° 3 sur les 5 clone le plus sécrétant puits les plus sécrétants

ELISA n° 4

~

_ _ _ _ _--:..7...::.5..1:P:..::U:.:..::it.=..s..:.;aL-ya:.:.;n...:..;.June

0.0.

> 1,5

P

assage en ascite

^~

^. ^du

^S'I.l

e ectlon ^du c one¹ clone le plus sécrétant le plus sécrétant pour la

suite de nos travaux

Tableau 20 : Résumé des différentes étapes de la fabrication d'hybridomes antic\1 antitrypsine.

Lors de cette première fusion nous n'avons pas, comme dans toutes celles qui suivent, un suivi précis des sécrétions car notre numérotation était renouvelée lors de chaque clonage. Il ne nous a donc pas été possible de suivre l'évolution individuelle de chaque clone mais nous avons tout de même pu constater une augmentation graduelle des 0.0. qui sont passées de 0,2 à 2.

3 • 1 •2 Fabrication d'hybridomes anti

13

lactoglobuline

La souche d'hybridomes anti ~ lactoglobuline que nous utilisons couramment dans notre laboratoire a

été

obtenue par fusion au PEG après immunisation "in vivo ".

3 - 1 - 2 - 1 Fusion après immunisation "in vivo"

3 - 1 - 2 - 1 - 1Protocole

- 5 souris femelles F1 de 8 semaines ont

été

immunisées. Elles ont reçu chacune 3 injections, à 3 semaines d'intervalle de 125 jJg de

f3

lactoglobuline additionnée de 125)J1 d'adjuvant complet de Freund.

- 2 mois après la première injection la souris qui avait le taux d'anticorps le plus élevé a

été

restimulée par 250 }lg de ~ lactoglobuline mélangé à 125 )JI d'adjuvant incomplet de Freund.

- 2 jours avant la fusion, les cellules de myélome PIAO ont été cultivées en OMEM + 10 % SVF en flacon spinner et leur temps de doublement a

été

estimé à 18 h.

- la fusion, en présence de macrophages, a

été

effectuée avec 1,2.10⁸ lymphocytes et 3.107 cellules de myélomes. Les cellules fusionnées ont

été

réparties dans 7 plaques de 96 puits à raison de 4,6.105cellules par puits en présence de milieu OMEM.

- 5 jours après la fusion, 58 % des puits présentaient un ou plusieurs clones. A 7 jours, ce pourcentage était passé à 80 %.

- Un premier test ELISA nous a permis de déterminer que 10,4 % des surnageants des puits avaient une densité optique supérieure à 0,2. Les cellules des 8 puits les plus sécrétants (DO de 0,38à 0,65) ont

été

clonées.

- Après 10 jours d'incubation, 55 % des puits présentaient un ou plusieurs clones et 15 % d'entre eux n'en présentaient qu'un seul. Le test ELISA n° 2 qui a suivi, nous a donné 71 % de puits dont le surnageant avait une 0.0. supérieure à 0,2.

- 133 .

- Les cellules des 8 puits les plus sécrétants (0.0. de 0,58 à 1,88) ont été à nouveau clonées et certaines d'entre elles ont été congelées (clone 2-4).

- Après 1

°

jours, 62 puits àun seul clone sont repérés (à ce stade seuls les puits à un seul clone sont pris en compte). 98 % d'entre eux donnaient des 0.0. > 0,3 (ELISA n° 3)

Les cellules de l'un d'entre eux (clone 2-6-2) ont alors été multipliées et injectées à des souris en vue d'une production d'ascite.

Les 1

°

plus sécrétants (0.0. > 1,5 à 1,9) ont alors subi un 3ème clonage.

Un 4ème test ELISA, sur 84 puits ne présentant qu'un seul clone a révélé que la 0.0. de 81 d'entre eux était supérieure à 1. Les 12 plus sécrétants (0.0. > 1,6) ont été multipliés et congelés. Le plus sécrétant d'entre eux a été multiplié et utilisé par F. MATI (thèse de Doctorat, 1992).

Ces différentes étapes sont résumées dans les tableaux 21 et 22.

Nous pouvons remarquer:

- Qu'à l'exception du 5-7-10-3, les 6 hybridomes les plus sécrétants sont issus du puits qui présentait la plus forte sécrétion dès le départ (0.0.

=

0,921 ).

- Le puits n° 2 (0.0.

=

0,683) nous a permis d'obtenir 4 hybridomes

stables.

- Les puits n° 3 et 4 dont les 0.0. étaient peu différentes de celles du puits n° 2 (0.0.

=

0,649 et 0,646) ont perdu leur sécrétion dès le premier clonage.

- Le n° 5 s'est maintenu jusqu'à la fin des clonages. Il est donc assez périlleux de ne sélectionner que 2 ou 3 clones lors de chaque test ELISA.

La multiplication du nombre de clonages rend donc ce travail très lourd et il est prudent de prévoir 3 mois entre le jour de la fusion et le moment où l'on obtient un hybridome que l'on peut supposer stable, c'est-à-dire qui ne va pas perdre sa capacité de sécrétion. De plus, on ne sait pas encore si les clones obtenus sont des hybridomes différents, soit par le patrimoine

135

-,.

672 p'uits

520 puits pr~sentants une prolifération cellulaire

+

(80 %)

ELISA nOl sur

~

175 puits

~---C-l-O-n-a-g-e--n-O--l--s-u-r--l-;t

8 plus sécrétants

cong~lation ^des ⁸ ^puits ~

ELISA nO 2 sur 56 puits présentant 1 ou 2 clones

+

Clonage nO 2 sur les 8 plus sécrétants

ELISA nO 3 sur 62 puits ne présentant qu'un seul clone

~

~ong~lation des 8 puits

S~lection

"---:ssage en de 10

Congélation des 3 plu sécrétants

ICong~la tian

.ELISA

Clonage nO 3 sur les 10 plus sécrétants

nO 4 sur 84 puits ne presentant qu'un seul clone

t,

des 12

+

plus sécrétants

a s d t t du clone

1.3~

Sélection du clone 1.3.^"

pour la suite de nos travaux

Tableau 21 : Résumé des différentes étapes de la fabrication d'hybridomes anti-J3 lactoglobuline_apr~s immunisation"in vivd'.

*

1 0,921 ~ 1.1

· ·

1~88

1

^f-~1.1.³

^· ·

^1,73 ^~ ^1.1.3.5

· ·

^1,81

.. 1.2

· ·

^1,82 ^1.2.8 : 1,65 ~ 1.2.8.4 : 1,83

r 1.2.8.10 : 1,75

~ 1. 3

· ·

^1,82 .. 1. 3. 6 : 1,68 ~ 1.3.6.1

· ·

^1,88

• 1.3.6.2 : 1,87

1.3. 7 ^: 1,65 ~ 1.3.7.9

· ·

^1,75

~ 1. 4 : 1,73 ^r 1.4.5

· ·

^1,72 ^1.4.5.6 ^: ^1,80

2 0,683 2.6

· ·

^0,89 ^{.. 2.6.1}

· ·

^1,89 .. 2.6.1.12

· ·

^1,46.

2.6.2

· ·

^1,82 .. 2.6.2.11 : 1,61

... 2.6.4 : 1,72 "2.6.4.8

· ·

^1,77

2.6.9 1,62· ... . .

. 1,78

: 2.6.9.7 :

3 0,649

4 0,646 4.5 : 1~18

5 0,643 ~ 5.7

_--

: 0,82 ~ 5.7.10

· ·

^1,50 ... 5.7.10.3

· ·

^1,84

6 0,523

7 0,485 ... 7.8 _: D,57

8 0,384

Tableau 22 :

Evolution des sécrétions (exprimées en

DO)

au cours des différents clonages d'hybridomes anti-~ lactoglobuline. ^t-'_W

génétique, soit par leur anticorps sécrété, car aucune analyse genétique et/ou immunologique n'a été réalisée pour caractériser les différents anticorps produits.

A ce stade, il est à noter que les congélations effectuées aux différentes étapes de cette expérience, si elles sont sécurisantes, ne sont pas très utiles car les hybridomes nouvellement créés, si ils sont faciles à cultiver après décongélation, perdent souvent leur pouvoir de sécrétion.

Par contre, les liquides d'ascites obtenus avec ces mêmes jeunes hybridomes ont généralement des concentrations en anticorps importantes.

3 - 1 - 2 - 1 - 2 Incidence de la durée de /'immunisation et du milieu de fusion

Cette fusion nous ayant donné de bons résultats, nous avons voulu étudier l'influence du temps écoulé entre les premières immunisations et l'injection de rappel. Nous avons donc travaillé sur le même lot de souris F1 femelles, mais en effectuant le rappel 7 mois après la première injection (au lieu de 2 mois).

De plus, nous voulions savoir si le milieu de base de la fusion influait sur son taux de réussite. Nous avons utilisé 2 souris et réalisé 2 fusions simultanées, l'une en milieu RPMI et l'autre en milieu DMEM que nous avons comparée avec la précédente réalisée 5 mois auparavant.

Nous avons pu établir le tableau comparatif n° 23 :

- 137

-Fusion n° 1 Rappel après 2 mois

en DMEM

Fusion n° 2 Rappel après7 mois

en DMEM

Fusion n° 3 Rappel après 7 mois

en RPMI

% de puits présentant une pousse cellulaire

Tableau 23 : Comparaison des rendements de fusion en fonction du temps d'immunisation et du milieu de culture.

Ces résultats font apparaitre que dans le même milieu (DMEM) une différence de cinq mois entre les 2 rappels n'apporte pas de changement notable au niveau du rendement de fusion tant au point de vue des puits présentant une pousse cellulaire (76 % - 80 %), qu'au point de vue des puits dits "positifs" c'est-à-dire dont le surnageant présente une 0.0. > 0,2 (13 % -11 %).

Une souris bien immunisée le reste longtemps et une simple injection de rappel permet d'obtenir une bonne réponse. Ces différences sont d'ailleurs d'autant moins significatives que chaque souris réagit légèrement différemment à une même dose d'antigène. Il est vrai que dans cette expérience, nous n'avons pas comparé les' taux d'Ac présents avant le rappel. Ces souris ayant déjà subi un prélèvement sanguin lors du choix de l'animal à sacrifier pour la première fusion.

Nous avons donc effectué nos autres expériences avec une injection de rappel environ 2 mois après la première immunisation.

Quant au milieu de fusion, les résultats étant là aussi comparables (72 %contre 80 % pour la croissance et 16% contre 11 % pour la sécrétion), nous avons choisi de continuer nos fusions avec le milieu DMEM.

3 - 1 - 2 -2 Fusion après immunisation "in vitro"

Notre souhait étant de réaliser des fusions après immunisations "in vitro" ,plus rapides et moins coûteuses en antigène, nous avons essayé tout d'abord de déterminer la concentration optimale en antigène.

3 - 1 - 2 - 2 - 1 -Etude de la relation concentration en antigène/nombre de puits sécrétants

Cette première étape, fondamentale pour la suite de nos travaux, a été réalisée sur 3 souris femelles F1 (BalbC/C57) agées de 8semaines.

Il fallait effectuer simultanément les 6 immunisations et les 6 fusions dans des conditions parfaitement similaires en faisant varier uniquement la quantité d'antigène.

Nous avons voulu couvrir en une fois un champ assez large et avons choisi les concentrations suivantes: 0,01 ; 0,1 ; 1 ; 10 ; 20 et 50 ug/ml.

Après avoir sacrifié 3 souris, nous avons récupéré et poolé les lymphocytes de leur rate et avons obtenu 3,6.10⁸ cellules que nous avons réparties dans 6 flacons (6.10⁷cellules par flacon).

Nous avons ajouté dans chaque flacon:

- 15 ml de "milieu thymocytes"

- 15 ml de SDMEM

- 0,5 ml de sérum de lapin

- et l'antigène à différentes concentrations.

Après 5 jours d'immunisation dans l'étuve à 8 % de CO₂ et à3TC , les lymphocytes ont été comptés et fusionnés avec les cellules de myélomes.

Après 5 jours de culture "in vitro" le taux de viabilité des lymphocytes était seulement d'environ 50 %.

- 139

-Les cellules fusionnées ont été réparties en plaque de 96 puits, en présence de macrophages, à une densité d'environ 2.10⁵cellules par puits.

Après 7 jours d'incubation, les puits présentant une pousse cellulaire ont été repérés et le test ELISA effectué au 10ème jour. Les résultats de ces différentes fusions sont rassemblés dans le tableau 24 :

Concentration en Puits présentant %age

0.0.

du puits 1¹

Ag enjJg/ml une pousse puits sécrétants le plus sécrétant

,

cellulaire en % 1puits testés 1¹

0,01 38,5 4,4 0,25

0,1 41,7 15 0,27

1 31,2 70 0,31

10 37,3 80,5 0,30

20 38,4 0 0

50 19,8 0 0

Tableau 24 : Pourcentage de réussite d'une fusion en fonction de la dose d'antigène utilisé pour l'immunisation "in vitro ".

" est donc à noter que, mis à part la concentration de 50 }Jg/ml qui semble diminuer le rendement de fusion, de 0,01 et 20 ]Jg/ml d'antigène le pourcentage de puits contenant des clones est tout à fait comparable.

Par contre, il semble clair que la concentration optimale pour obtenir un maximum de puits sécrétants soit comprise entre 1 et 10 jJg/ml pour cet antigène. Nous utiliserons donc pour la suite de nos travaux la concentration de 8jJg/ml de _~ lactoglobuline.

Cette étude n'a pas été poursuivie au-delà puisque nous avions déjà stabilisé une souche d'hybridome anti B lactoglobuline. Par contre, le clone ayant une 0.0. à 0,315 a été multiplié et les cellules injectées à une souris.

Après 6 jours, un liquide d'ascite s'est développé mais s'est révélé négatif lors du test ELISA. Il est probable que les cellules n'étaient pas suffisamment

"stabilisées" et qu'elles ont perdu rapidement leur pouvoir de sécrétion.

3 - 1 - 2 - 2 - 2 Première fusion après immunisation "in vitro"

Notre première fusion après immunisation "in vitro" a été réalisée sur une souris femelle F1 de 10 semaines.

Les cellules de la rate ont été placées dans un flacon de 75 cm2 en présence de 15 ml de milieu thymocyte, 10 ml de milieu SDMEM, 2,5 % de sérum de lapin et 200 ug de B lactoglobuline filtrée (8 ug/ml).

Après 5 jours d'incubation à 3TC, 8 % de C02, les lymphocytes ont été dénombrés : 5.10⁷ (une rate contenant au moins 1.10⁸ lymphocytes, on constate une perte de 50 % après 5 jours de culture "in vitro ")

Ils ont été fusionnés avec 2,5.10⁷ cellules de myélomes (dont le temps de doublement était de 16,6 h) et répartis dans 5 plaques à raison de 1,5.10⁵ cellules par puits et placés à3TC, 8 % de CO2.

Après 6 jours de culture, 30 % des puits présentaient une pousse cellulaire (au lieu de 80 % après immunisation "in vivo "). Ils ont été testés par un test ELISA.

Les étapes suivantes sont les mêmes que lors de la fusion après immunisation"in vivo" :

- 6 clonages ont été effectués sur les 6 puits ayant une sécrétion> 0,2 0.0.

- Après le 2ème test ELISA, 6 nouveaux clonages ont été réalisés sur les 6 puits présentant une 0.0. > 0,1.

- Au 3ème clonage, tous les puits avaient perdu leur sécrétion.

Les tableaux 25 A et 25 B relatent le suivi du travail et l'évolution des sécrétions. Le principe de la dénomination des clones reste le même que précédemment.

141

-480 puits

144 puits présentant un}pousse cellulaire (30 %) _ _ _ _ _ _E_L_IS_A_n_o_1_s_ur les 144 puits

~

~ ~

Congélation de 6 puits présentant une 0.0. > 0,2 (4 %)

3 puits (3-4-5)

~

6 clonages

ELISA n° 2 sur 162 puits "positifs" (28 %)

~

6 puits ayant une 0.0. < 1

~--~-î

Restimulation des 6 clonages

clones 2-2 et 4-5

~

ELISA n° 3 négatif

Tableau 25 A : Résumé du suivi de la fusion après immunisation "in vitro".

ELlSAn· 1 ELISA n' 2 ELISA n· 3

0.0. 0.0. 0.0.

1 0,91

2 0,55 ^JI" 2.1

· ·

^0,24 ^'0

~ 2.2 0,21

°

... 2.4

·

0,14

°

3 0,50.

4 0,22. ^JI" 4.3

· ·

^0,15

--r

4.5

·

^0,14

°

~ 4.6 0,11

°

5 0,20.

6 0,19

Tableau 25 8 : Evolution des sécrétions au cours des différents clonages lors de la fusion après immunisation "in vitro".

La comparaison de 2 fusions, l'une après immunisation en'"in vivo" et l'autre "in vitro" est assez intéressante.

- Le pourcentage de puits présentant une pousse cellulaire passe de 80%

à

30 %.

- De plus 4 % seulement de ces clones (2 et 3) sont sécrétants (contre 10 à16 %).

- Après le premier clonage, seuls 2 puits permettent de retrouver des cellules sécrétant encore. Et si cela se comprend pour les clones 5 et 6 qui avaient dès le départ des sécrétions très faibles; il est plus surprenant que le

clone n° 1, qui avait une sécrétion nettement supérieure aux autres, soit devenu négatif aussi rapidement.

Ayant perdu toute sécrétion après l'ELISA 3, nous avons tenté de redécongeler les puits 3, 4 et S. Mais, encore une fois, après 3 semaines de congélation, nous n'avons pu que constater la perte de sécrétion.

3 - 1 - 2 - 2 - 3 Essai de restimulation des clones

Devant la chute rapide des sécrétions lors de l'ELISA 2, en plus des 6 clonages, nous avons tenté de réaliser une restimulation de la sécrétion sur les clones 2-2 et 4-S. Pour cela, après les avoir fait proliférer, ils ont été aliquotés chacun dans 3 puits contenant 1,S ml de milieu rCM et mis en présence 1 ou 10 ug de B lactoglobuline diluée dans O,S ml de milieu SDMEM pendant Sjours.

Cet essai est resté sans résultat. Les sécrétions ne sont pas réapparues.

3 - 1 - 2 - 2 - 2 - 4 Essai de diminution du temps d'incubation des lymphocytes

Le mauvais état des lymphocytes après Sjours de culture "in vitro" est sans doute l'élément déterminant le petit nombre de clones positifs lors du premier ELISA mais il n'explique sans doute pas le fait que les rares clones sécrétants deviennent négatifs après le deuxième clonage.

Nous avons essayé de réduire ce temps d'incubation de 3 à Sjours. Les lymphocytes sont, en effet, restés en meilleur état, mais nous n'avons obtenus aucun clone sécrétant.

3 - 1 - 2 - 2 - 5 Essai d'augmentation de la dose d'antigène

Les sécrétions lors de la première fusion étant restées relativement faibles, nous avons tenté, tout en restant dans la fourchette optimale déterminée au paragraphe 3-1-2-2-1, d'augmenter la dose d'antigène. Nous sommes donc passé, pour l'immunisation, de 8 à 12 ug/ml de B lactoglobuline.

- 307 puits où il y avait pousse cellulaire (80 %)

- 61 puits présentant 1 sécrétion supérieure à 0,3 de 0.0. (20 %) - Les 8puits les plus sécrétants ont été clonés:

145

- Mais n'ont donné aucune réponse lors de l'ELISA suivant.

Les sécrétions étaient lors de cette expérience très nettement supérieures à celles de la précédente puisqu'elles allaient jusqu'à 2,3 mais un seul clonage a suffi pour qu'elles disparaissent toutes. Nous n'avons trouvé aucune explication à ce phénomène.

Comme l'on fait de nombreux auteurs, nous avons pensé ajouter un glycopeptide pour essayer de stabiliser la sécrétion.

3 - 1 - 2 - 2 - 6 Fusion après ajout de MOP

Cette expérience a été réalisée sur une souris Balb C femelle agée de trois mois.

Le milieu d'immunisation avait la composition suivante:

- B lactoglobuline

Les lymphocytes lors des fusions précédentes étant très altérés (ou morts à 50 %), nous avons supposés qu'en présence de MOP, stimulant la réponse immunitaire, il était possible de les cultiver seulement 3 jours.

Nous avons, pour cette raison et au vu du nombre important de lymphocytes de cette rate, augmenté légèrement la concentration de l'antigène (10

P9

au lieu de 8).

Après 3 jours de culture, nous n'avions plus que 6,4.10⁷ lymphocytes qui ont été fusionnés avec des cellules de myélomes dont le temps de doublement était de 13 heures.

Les cellules fusionnées ont été réparties dans 7 plaques à raison de 2.105cellules par puits.

La succession d'ELISA et de clonages, toujours la même est résumée dans le tableau 26 :

672 puits

~

636 puits présentant une prolifération cellulaire (95 %)

~

ELISA n 1 sur les 636 puits 50 puits sécrétants DO

~

> 0,2 (8 %) Clonage n° 1 sur les 10 plus sécrétants

~

ELISA n° 2 sur 217 puits monoclonaux

~

2 puits positifs DO

~

> 0,2 (1 %) Clonage n° 2 de 4 puits

~

~ ^,

ELISA n° 3 sur 90 puits monoclonaux négatif

~

Tableau 26 : Résumé des différentes étapes de l'expérience.

L'évolution des sécrétions peut être résumée ainsi:

ELISA n° 1 ELISA n° 2 ELISA n° 3

0.0. 0.0. 0.0.

1 : 0,767

2 : 0,726 2.3 0,148 0

3 : 0,695 3.4 0,143 0

4 : 0,665 4.1 0,929 0

5 : 0,647 6 : 0,584 7 : 0,515 8 : 0,514

9 : 0,510 9,2 0,199 0

10 : 0,507

Tableau 27 : Evolution des sécrétions au cours des 3 tests ELISA suivant la fusion après immunisation "in vitro" en présence de MDP.

La présence de MDP ne semble pas améliorer en quoi que ce soit la stabilisation de la sécrétion de ces jeunes hybridomes et nous avons alors voulu tenté ce qu'on pourrait appeler une immunisation mixte; c'est-à-dire, d'abord une immunisation "in vivo" suivie d'une immunisation "in vitro ".

3 - 1 - 2 - 3 Fusion après immunisation mixte

Cette immunisation "in vivo" a été réalisée sur une souris Balb C femelle agée de 12 semaines, avec 200 }.Jg de

J3

lactoglobuline injectés en présence de CFA en intrapéritonéal.

Après 10 jours, les lymphocytes de la rate ont été récupérés selon le protocole habituel et l'immunisation "in vitro" a été réalisée dans le milieu suivant:

- 15 ml de milieu TCM - 15 ml de milieu SDMEM - 0,5 ml de sérum de lapin - 400 }JI de MDP (13 }.JI/ml)

- 300 ,ug de B lactoglobuline (10 }Jg/ml) - 1,4.10⁸ lymphocytes

147

-Après 3 jours d'incubation à 3TC avec 8 % de C02 la fusion a été

- -

-réalisée avec 3,5.10⁷ cellules de myélomes dont le temps de doublement était de 15 h.

Nous avons diminué ici le rapport lymphocytes/myélomes afin de diminuer les risques de fusion myélome-myélome.

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