CELL
INOCULATION TUBE
Figure 6 : schéma d'un système de fibres creuses (Biotechnology vol.3 Mars 1985)
Il existe des variantes de ce système :
- le lit plat de fibres creuses où le milieu est envoyé perpendiculairement àl'axe des fibres,
- le système à fibres mixtes où gaz et milieu circulent dans des fibres différentes,
- le système de ADEMA où les cellules se développent à l'intérieur des fibres.
* Les microcapsules : Les cellules sont dans ce cas, retenues
à
l'intérieur de microbilles poreuses, maintenues en suspension dans des systèmes de culture classiques (HU, 1985). Les microbilles sont constituées par des membranes de polymères au travers desquelles, oxygène et nutriments diffusent alors que les produits cellulaires sont retenusà
l'intérieur des microcapsules. Les coûts de l'encapsulation et de la récupération des produits sont élevés, mais les densités cellulaires atteignent 108 cellules/ml (Figure 7).La biomasse concentrée à l'intérieur des microcapsules forme un écran aux échanges.
La microencapsulation s'effectue selon deux techniques:
- Avec un alginate de calcium :
Les cellules sont mises en suspension dans une solution d'alginate et tombent goutte
à
goutte dans une solution de chlorure de calcium où elles Ise"gélatinisent", puis sont trempées dans une solution de poly-L-Iysine qui polymérise à leur surface. Enfin, l'intérieur des billes est reliquéfié par une solution de citrate de sodium. Les cellules se trouvent alors à l'intérieur de capsules microporeuses.
- Avec une émulsion agarose / paraffine:
Les cellules sont placées en présence d'agarose dans un tube
à
centrifuger contenant de l'huile de paraffine. Un vibromélangeur provoque l'émulsion.Figure 7 : Les cellules sont immobilisées à l'intérieur des billes. Nilsson (1980)
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-* Les systèmes à lit fluidisé : (Figure 8) 1
Dans ce procédé appelé VERAX, les cellules sont là aussi immobilisées dans des microbilles de collagène, lestées avec des particules d'inox et agitées par un lit fluidisé (DEAN , 1987)
RECYCLE-flDW
I=inl m:l A . n~n~ lA ~vc::tÀmA rip. lit fhJidisé. lescellules sont immobilisées.
• Les microporteurs :
2 à 3 grammes de microbilles poreuses de 200 }lm de diamètre contituées de membranes de polymères sont déposés dans le milieu de culture. Après quelques heures, les cellules se fixent à l'extérieur des billes.
(Figure 9).
Figure 9 : cellules CHO fixées àla suMace du microporteur.
.. Les lits spongieux
Les cellules sont piégées dans une mousse de polyéther. Elles nichent dans les lumières de l'éponge et s'y développent alors que toutes les régulations du milieu se font dans un bioréacteur connecté en série. Une pompe péristaltique permet l'arrivée du milieu neuf et l'expulsion du milieu usé.
Figure 10: Le système à cellules piégées dans un lit spongieux utilisé au laboratoire
- ) 1
1 • 3 • 2 •
3 Culture de cellules en suspensionCe sont des systèmes agités où les cellules poussent en suspension homogène dans un milieu de culture contrôlé et régulé en permanence. Ce principe est très intéressant et son automatisation est relativement aisée (SIRCH, 1986).
Des prélèvements réguliers permettent différents dosages en fonction desquels on peut apporter telle ou telle modification aux conditions de culture en fonction du métabolisme cellulaire.
La capacité de la cuve du réacteur peut aller de quelques litres au laboratoire, à plusieurs milliers dans l'industrie et ainsi compenser par des volumes importants, la concentration cellulaire qui reste relativement faible (106cellules/ml).
Plusieurs techniques de culture peuvent être adoptées:
- Soit le "batch" qui consiste à ensemencer le bioréacteur et à laisser la culture évoluer sans ajouter ni soutirer du milieu. Les cellules se trouvent dans un environnement variant en permanence. L'épuisement des nutriments et l'accumulation des déchets toxiques entrainent assez rapidement l'inhibition de la croissance ou de la production cellulaire (GLACKEN et al., 1983): La culture ne peut se poursuivre que 4 à 5 jours mais la consommation de milieu n'est pas très importante.
- Soit le "Fed-batch" dans lequel on apporte des nutriments en fonction des besoins des cellules. La concentration en éléments nutritifs est ainsi maintenue constante mais les déchets métaboliques s'accumulent au cours du temps. Le temps de la culture s'en trouve tout de même un peu prolongé (12 à 1,5 jours).
- Soit la culture dite en perfusion ou continue qui consiste à injecter en continu du milieu frais et à soutirer un volume équivalent de milieu usé. La densité cellulaire peut ainsi atteindre 3.107 cellules/ml pendant un temps de culture qui peut aller jusqu'à quelql,.;es mois (MARTIN et al., 1986).
Mais ces différents modes de culture comportent toutefois quelques inconvénients:
• Les cellules se trouvent en proie
à
des forces de cisaillement dues aux pales qui agitent en permanence le milieu de culture. Aussi, de nombreux systèmes ont été mis au point pour palier ces inconvénients (FEDER et TOLBERT, 1983 ; GRIFFITHS, 1986).Des hélices marines ont remplacées les turbines
à
pales rigides. Elles1
favorisent l'écoulement axial qui assure une homogénéité correcte, même
à
faible vitesse.
- Des agitateurs à pales souples de plu!? grande surface permettent de diminuer les forces de cisaillement.
- des vibramélangeurs constitués d'un disque perforé animé d'un mouvement vertical de va-et-vient ;(Figure 12 )
- des agitateurs à circulation d'air (procédé Air lift), utilisés pour des réacteurs de gros volumes (BIRCH et al,) 1986). Le gaz est introduit
à
la base d'un tube vertical. Il provoque une circulation du milieu qui monteà
l'intérieur du tube puis redescend le long de ses paroies externes (BIRCH, 1986) (Figure 11).Steam to sterirlse
Sterile medium - - - -__
Filter
39
-Inoculum - - - . ,
o
Exhaust gases
Filter Air inlet
pH Temp Dot
Draught tube
db 1
1