RESULTATS COMPLEMENTAIRES, INTERPRETATIONS & DISCUSSION

Les résultats présentés dans l’article I montrent pour la première fois in vivo que l’insuline, à une concentration physiologique, induit une élévation du niveau d’EAOs (H2O2) dans le système nerveux central, et plus particulièrement dans l’hypothalamus. Cette augmentation du niveau d’EAOs est nécessaire à l’effet anorexigène de l’insuline, démontrant ainsi la relevance physiologique de cette signalisation. De plus, nous révélons l’implication de la NOX dans cette signalisation.

Les résultats de l’article I mettent également en évidence que la restriction alimentaire totale de 18h (jeûne) ou la mise sous régime hyperlipidique hypercalorique pendant 3 jours (HFD, High-Fat Diet) suppriment l’élévation hypothalamique du niveau d’EAOs induite par l’insuline et l’effet anorexigène de cette hormone. En d’autres termes, un déficit comme un excès d’énergie entraîne une perte de sensibilité à l’insuline. On peut donc se poser la question suivante: comment expliquer que deux situations nutritionnelles apparemment opposées aient la même conséquence sur la sensibilité à l’insuline ?

Dans l’article I, nous montrons que ces deux situations nutritionnelles apparemment opposées, entraînent une augmentation dans l’hypothalamus de la quantité de glutathion réduit (GSH) qui constitue un système anti-oxydant majeur de la cellule. Nous avons proposé que cette augmentation des défenses anti-oxydantes soit responsable de l’absence d’élévation du niveau d’EAOs en réponse à l’injection icv d’insuline, et donc de la perte de sensibilité à l’hormone. Nous avons émis l’hypothèse que ce phénomène soit dû à l’afflux d’acides gras libres (AGL), provenant de la lipolyse dans le cas du jeûne et de l’apport alimentaire dans le cas du régime HFD. Cet afflux d’AGL entraînerait une augmentation de la β-oxydation mitochondriale et, consécutivement, celle de la respiration, conduisant ainsi à une production accrue d’EAOs. En retour, afin de préserver l’intégrité cellulaire, les défenses anti-oxydantes seraient augmentées, permettant ainsi de piéger l’excédent d’EAOs, mais supprimant aussi l’élévation transitoire de la quantité d’EAOs induite par l’insuline. Nous avons privilégié cette hypothèse en raison des données existantes de la littérature concernant les effets du jeûne et de l’hyperlipidémie dans l’hypothalamus sur les défenses anti-oxydantes.

Néanmoins, les acides gras sont aussi connus pour moduler l’activité de la NOX. En effet, l’exposition des adipocytes 3T3-L1 aux acides gras entraîne une forte production

d’EAOs, qui disparaît en présence d’inhibiteurs de la NOX (Furukawa et al. 2004). De manière similaire, le niveau élevé d’EAOs dans les adipocytes issus de souris soumises à un régime HFD de longue durée peut être restauré en traitant les cellules avec des inhibiteurs de la NOX (Talior et al. 2005). De plus, dans le muscle de ces souris, la surproduction d’EAOs est également dépendante de l’activité de la NOX (Bonnard et al. 2008). Finalement, au niveau du SNC, un régime HFD de longue durée induit une surproduction d’EAOs, qui a été attribuée à la surexpression cérébrale des sous-unités de la NOX (Zhang et al. 2005).

Au regard de l’ensemble de ces données, il est donc possible que, dans nos conditions expérimentales, et plus particulièrement lorsque les souris sont soumises à un régime HFD, la stimulation de la NADPH oxydase par les AGL dans l’hypothalamus soit aussi en partie responsable de l’augmentation des défenses anti-oxydantes que nous mettons en évidence.

En plus de l’augmentation des défenses anti-oxydantes, nous avons cherché à savoir si les quantités hypothalamiques des sous-unités α et β du récepteur à l’inuline (RI) contenues dans l’homogénat tissulaire total et plus spécifiquement dans les membranes plasmiques purifiées (cf Annexes, Matériel & Méthodes) variaient entre les trois conditions expérimentales testées (régime standard, jeûne, et régime HFD). La détection par Western Blot des sous-unités α et β du RI dans l’homogénat tissulaire total et les membranes plasmiques de l’hypothalamus (FIGURE 23A) montre que le jeûne et le régime HFD n’altèrent pas leur quantité (FIGURE 23B). Ces résultats sont en accord avec la littérature qui rapporte qu’il n’existe pas dans le SNC de régulation positive de l’expression du RI en cas de déficit énergétique et/ou d’hypo-insulinémie (jeûne ou diabète de type I), ni de régulation négative en cas d’excès énergétique et/ou d’hyper-insulinémie (rat Zucker fa/fa, souris ob/ob, ou souris soumises sur un long-terme à un régime HFD) (cf Introduction III.B.2.a).

L’ensemble de ces données suggère donc que l’altération des effets centraux de l’insuline ne peut pas être attribuée à un défaut de la quantité de RI. Lors de l’altération des effets centraux de l’insuline par un régime HFD de courte durée (1 jour), notamment sur le contrôle de la production hépatique de glucose, la quantité hypothalamique de RI ne varie pas alors que la phosphorylation de IRS-1 induite par l’insuline est diminuée (Ono et al. 2008). De plus, le jeûne entraîne au niveau du SNC une diminution de la phosphorylation d’Akt (Clodfeldder-Miller et al. 2005), suggérant ainsi une altération de la transduction du signal en cas de stimulation avec l’insuline. Ces données, associées aux nôtres, montrent que plusieurs étapes de la voie de signalisation de la PI3K (EAOs, IRS-1, Akt) indispensable aux effets

A

B

C

FIGURE 23 : Effets du jeûne (A-B) et du régime HFD (A-C) sur la quantité des sous-unités α (RI-α) et β (RI- β) du récepteur à l’insuline (RI) dans l’extrait total et les membranes plasmiques de l’hypothalamus. La quantité relative de chaque sous-unité est exprimée en pourcentage par rapport au régime standard (STD). n = 3 dépôts d’homogénats d’hypothalami de 4 souris, par condition nutritionnelle et par sous-unité de RI détectée.

physiologiques de l’insuline, sont rapidement altérés par le jeûne et le régime HFD. Or, la production d’EAOs, dérivée de l’activité de la NOX, permet une amplification de la transduction du signal de l’insuline via l’inhibition de PTP1B, régulateur négatif de la phosphorylation du RI et de IRS-1, et via l’inhibition de PP2A, régulateur négatif majeur d’Akt (cf Introduction IV.E.1). Par conséquent, en absence d’induction de signal oxydant (due aux défenses anti-oxydantes augmentées), la régulation négative de la phosphorylation du RI, d’IRS-1 et d’Akt ne pourrait être levée lors de la stimulation avec l’insuline. L’activation de la voie de la PI3K étant essentielle à la régulation de l’expression des neuropeptides NPY/AgRP et POMC responsables de l’action anorexigène de l’insuline (cf Introduction III.B), l’altération de cette voie pourrait expliquer la perte d’effet de l’hormone sur le comportement alimentaire.

En résumé, la stimulation de la NOX et/ou du métabolisme mitochondrial dus à l’augmentation des AGL dans l’hypothalamus pourrait entraîner une augmentation des défenses anti-oxydantes, et ainsi empêcher l’activation de la voie de la PI3K, essentielle à l’effet anorexigène de l’insuline (FIGURE 24).

PARTIE II : LES EAOs : NOUVEAUX ACTEURS DE LA

SIGNALISATION

HYPOTHALAMIQUE

DE

L’INSULINE

NECESSAIRE AU CONTROLE DE LA PRISE ALIMENTAIRE.

Rôle de la chaîne respiratoire mitochondriale.

A. INTRODUCTION & DEMARCHE EXPERIMENTALE

Dans la première partie (Article I), nous avons démontré que l’effet anorexigène de l’insuline est dépendant d’une voie de signalisation hypothalamique impliquant les EAOs, notamment celles dérivées de la NOX. Or, dans les neurones, les EAOs dérivées de la CRM font également partie de la signalisation de l’insuline (Storozhevykh et al. 2007, Storozheva et

al. 2008). Nous avons donc voulu savoir si l’activité de la CRM dans l’hypothalamus

prenaient également part à l’effet anorexigène de l’insuline.

1) Pour tester l’implication de la CRM et confirmer celle de la NOX dans l’action hypothalamique de l’insuline, nous avons utilisé in vivo, suivant le même protocole d’injection que celui utilisé dans l’article I, deux agents pharmacologiques qui altèrent leurs capacités à produire des EAOs (l’apocynin pour la NOX et le CCCP pour la CRM). Nous montrons ainsi que les effets de l’insuline sur l’élévation du niveau d’EAOs et l’inhibition de la prise alimentaire dépendent des EAOs dérivées de la NOX et de la CRM.

2) Nous avons ensuite cherché à déterminer si l’insuline était capable in vivo, dans l’hypothalamus, de moduler l’activité de la CRM. Nous avons utilisé le même protocole d’injection que celui décrit dans l’article I. Les hypothalami ont été prélevés 15min après l’injection icv d’insuline, au moment où se produit le pic d’EAOs dépendant de l’activité de la NOX. L’effet de l’insuline sur l’activité de la CRM a été évalué par mesure de la respiration mitochondriale. Nous montrons que l’insuline diminue les capacités respiratoires maximales mitochondriales. L’analyse pharmacologique plus fine de la respiration, réalisée ex-vivo et sur hypothalamus perméabilisé, montre que l’insuline (10min d’exposition) inhibe la respiration mitochondriale en limitant l’utilisation des substrats par les CI et II de la CRM.

3) Les EAOs pouvant inhiber l’activité des complexes de la CRM, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle elles interviennent dans l’effet inhibiteur de l’insuline sur la respiration. Pour tester cette hypothèse, nous avons pré-incubé les hypothalami perméabilisés avec un antioxydant (le trolox) pendant 10min, avant l’ajout d’insuline. Nous montrons ainsi que l’effet inhibiteur de l’insuline sur la respiration dépend des EAOs.

4) Suivant la même stratégie expérimentale, la pré-incubation des hypothalami perméabilisés avec un inhibiteur de l’activité de la NOX, l’apocynin (10min d’exposition), avant l’ajout d’insuline, montre que l’effet inhibiteur de l’insuline sur la respiration dépend des EAOs dérivées de la NOX.

5) L’activité de la CRM représentant 80% de la production basale d’EAOs de la cellule, nous avons voulu tester si les EAOs d’origine mitochondriale intervenaient également dans l’effet inhibiteur de l’insuline sur la respiration. La pré-incubation des explants avec un agent découplant, le CCCP (10min d’exposition), avant l’ajout d’insuline, montre que l’effet inhibiteur de l’insuline sur la respiration est aussi dépendant des EAOs mitochondriales.

6) Dans l’article I, nous avons démontré que dans une situation de perte de sensibilité cérébrale à l’insuline (trois jours de régime HFD), l’élévation de la quantité d’EAOs qu’induit l’hormone est supprimée. Pour l’article II, nous avons réutilisé cette condition nutritionnelle afin de tester si l’altération de la « signalisation EAOs » était liée à une perte de l’effet inhibiteur de l’insuline sur la respiration. Nous montrons que trois jours de régime HFD induit, dans l’hypothalamus, une altération de la respiration mitochondriale associée à une perte de l’effet inhibiteur de l’insuline sur la CRM.

7) L’analyse de l’ensemble des résultats obtenus dans l’article I et II, en prenant en compte les différents traitements pharmacologiques utilisés (vehicules, trolox, apocynin, CCCP, ± insuline, régimes standard ou HFD), montre que le niveau de prise alimentaire dépend du taux d’EAOs et de l’activité de la CRM, qui sont eux-mêmes dépendants l’un de l’autre.

L’ensemble de ces résultats nous permet donc de démontrer l’implication de la CRM dans l’effet anorexigène de l’insuline. Nous proposons que les EAOs dérivées de la NOX et

de la CRM permettent à l’insuline d’inhiber la respiration mitochondriale et d’élever le niveau d’EAOs, conduisant ainsi à l’inhibition de la prise alimentaire.

B. RESULTATS