Reprogrammation des cellules d'urine

3.2.1 La transduction

Le jour de la transduction, les puits jumeaux ont été comptés et ont donné les comptes suivants : 230 000, 210 000, 129 000 et 123 000 cellules par puits. La quantité de virus est calculée à l'aide du calcul énoncé dans la partie 2.2.2.2 La transduction. Afin de faciliter les calculs, on a utilisé le logiciel Excel pour déterminer les quantités de virus requises pour chaque puits. Pour une

Figure 12 - Morphologie des cellules d'urine avant la transduction pour la lignée #21

Les cellules ici sont ensemencées à 200 000 cellules dans une boîte de Petri de 35 mm. Cette photo est prise deux jours après l'ensemencement, c'est-à-dire le jour de la transduction. (Jour 0)

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concentration cellulaire entre 123 000 et 230 000 cellules et un MOI de 5-5-3 ou 5- 5-6, la quantité de virus varie entre 2 et 10 µl pour chacun d'eux. (Tableau 9)

Tableau 9 - Tableau d'aide aux calculs pour la transduction

Reprogrammation lignée #21 #Lignée-puits Nombre de cellules Virus hKOS hc-Myc hKlf4 J 0 MOI Volume (µL) MOI volume (µL) MOI volume (µL) #21-1 230 000 5 8,8 5 9,6 3 4,9 #21-2 210 000 5 8,1 5 8,8 6 9,0 #21-3 129 000 5 5,0 5 5,4 3 2,8 #21-4 123 000 5 4,7 5 5,1 6 5,3

Total virus utilisé (µL) 26,6 28,8 22,0

Volume restant 73,4 71,2 78,0 Volume disponible (µL) 100 100 100 Virus Titre (virus/ml) Titre (virus/µL)

hKOS 1,30E+08 1,30E+05

hc-Myc 1,20E+08 1,20E+05

hKlf4 1,40E+08 1,40E+05

Pendant les 7 premiers jours post-transduction, les cellules subissent des changements morphologiques très importants. En effet, les cellules semblent vouloir se regrouper comme pour former des débuts de colonies. (Figure 13) Etant donné le potentiel infectieux du virus de Sendaï, beaucoup de mortalité est également observé. Ceci prouve que l'infection fonctionne. Aucune différence significative au niveau de la mort cellulaire ou des changements morphologiques n’est notée entre chaque puits de concentration cellulaire différente. Le passage sur MEF s'est fait dans trois boîtes de Petri, à trois densités différentes : 20 000, 50 000 et 100 000 cellules. Les MEF sont ensemencés sur gélatine la veille à environ 167 000 cellules par boîte de Petri. Dès le premier jour sur MEF, les cellules transduites se divisent pour former des débuts de clones. Ils grossissent jusqu'à environ une vingtaine de jours avant le piquage.

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3.2.2 La formation des clones

Sur la figure 14, on peut voir l'évolution d'un des clones montrant sa croissance rapide entre le jour 1 et 8 sur MEF. A ce stade, les clones sont très bien visibles, mais encore trop jeunes et petits pour être piqués. Il n'est pas bon d'avoir trop de clones car les clones pourraient fusionner entre eux. S'il n'y a pas ou pas assez de clones dans la boîte de Petri c'est que la transduction n'a sûrement pas bien

Figure 13 - Morphologie des cellules d'urine à 7 jours post-transduction

Les cellules changent de taille et de morphologie pendant les 7 premiers jours post-transduction et viennent se rassembler pour former des sortes de ronds qui ressemblent à des colonies d'hiPSCs. Ces cellules sont retrouvées dans le puits #21-1.

Figure 14 - Morphologie d'un clone de la lignée #21 du jour 1 à 8 sur MEF

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fonctionné. Pour cette expérience, on avait entre 1 et 25 clones par boîte de Petri. (Figure 14)

3.2.3 L'immunofluorescence sur cellules vivantes

Avant de piquer les clones, il faut les sélectionner via une immunofluorescence sur cellules vivantes. Cette étape est réalisée ici au bout de 21 jours de culture sur MEF. Sur la figure 15, on note l'expression des marqueurs choisis sur des clones potentiels. Les clones ayant une morphologie bien définie et ronde et exprimant un des marqueurs de surface choisis pour la pluripotence sont sélectionnés.

3.2.4 La sélection des clones

Pour augmenter les chances d'obtenir des clones qui donneront des hiPSCs, il est nécessaire d'en piquer le plus possible. Pour cette lignée, 15 clones au total ont été piqués à 3 jours d'intervalle. C'est en moyenne après 2 jours qu'on peut savoir si le clone est un bon clone ou non.

3.2.4.1 Les bons clones

Parmi les 15 clones piqués, seulement trois d'entre eux se sont distingués positivement : les clones 4, 7 et 8. Après seulement 24h sur le matrigel, un des clones a adhéré et commencé à proliférer pour donner des cellules ressemblant à des cellules hiPSCs. Pour les deux autres, il a fallu attendre deux ou trois jours de plus. (Figure 16) Au bout de 7 jours, les clones sont passés à la Dispase manuellement. Ceci implique de décoller les bouts de colonies grâce un embout de 1000µl et de les récupérer directement pour les réensemencer sur matrigel. Cette démarche est réalisée lorsque la colonie est trop petite pour être passée avec le grattoir ou le pipetage. L'amplification des clones s'est bien déroulée pour les

Figure 15 - Représentation de trois clones exprimant un des marqueurs de pluripotence

Ici, la plupart des clones de la lignée #21 expriment les trois marqueurs de surface choisis. Les petites cellules autour des clones qui sont marquées sont peut-être des cellules transduites qui ont du mal à se diviser car elles étaient déjà sénéscentes avant la transduction, ou simplement du bruit de fond.

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clones 7 et 8 jusqu'à plus de 20 passages, mais les cellules se sont différenciées pour le clone 4 après le quatrième passage. Seul le clone 8 a été utilisé pour la caractérisation, car il donnait les plus belles colonies d'hiPSCs. Finalement, pour les autres clones sélectionnés, il s'est avéré qu'ils ne donnaient pas d'hiPSCs. (Voir la partie 3.2.4.2 Les mauvais clones).

3.2.4.2 Les mauvais clones

Après 24h de culture, certains clones piqués se différencient, meurent ou parfois adhèrent mais ne donnent pas d'hiPSCs. La figure suivante montre les différents exemples de clones n'ayant rien donné. Le clone 11 s'est différencié au bout d'un jour de culture. Le clone 5 a commencé à mourir au bout de 5 jours, et le clone 9 a adhéré mais n'a jamais donné de cellules hiPSCs. (Figure 17) Au total, trois clones sur quinze ont donné des hiPSCs, même si un d'entre eux s'est différencié. Parmi les mauvais clones : un clone s'est différencié après 24h de culture, sept clones

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ont adhéré mais n'ont pas donné d'hiPSCs et quatre autres sont morts après 24h ou n'ont pas adhéré.

3.2.5 Culture et amplification des hiPSCs

Les cultures d'hiPSCs sont gardées ici en culture pour au moins 20 passages. (Figure 18) Au bout des passages 5, 10, 15 et 20, des congélations sont réalisées afin de garder un stock de ces cellules dans l'azote liquide. Les cellules sont récoltées vers le passage 5 pour pouvoir réaliser les RT-PCR, et sont aussi fixées à la PFA pour l'immunofluorescence.