U NE REPONSE A DES BESOINS SPECIFIQUES POUR LE DIAGNOSTIC

Les tests d’analyse dans le domaine médical doivent aujourd’hui être multiparamétriques, permettant ainsi d’obtenir le plus d’informations possibles en un temps réduit. De plus, le nombre d’échantillons à tester est en constante augmentation, générant une réelle demande pour de nouveaux supports d’analyse multiplexée à haut-débit. Les biopuces à protéines ou à ADN font partie des nouveaux procédés analytiques pouvant être utilisés dans ce cadre. Une puce destinée au diagnostic, au criblage ou au suivi doit ainsi permettre une analyse sensible, fiable et reproductible, être simple d’utilisation et peu coûteuse. Un nombre restreint de protéines sondes est en général utilisé, de façon à réduire les difficultés d’analyse des résultats, mais celles-ci doivent être représentatives de la pathologie ciblée. Les supports utilisés doivent être adaptés à des protocoles peu coûteux et automatisés, réduisant ainsi le risque d’erreur, simplifiant l’utilisation et augmentant la reproductibilité des tests. La production à grande échelle de ces puces doit également être facilitée grâce à la robotisation complète des procédés.

Les puces à protéines développées dans le cadre de cette thèse permettent de répondre à ces attentes, grâce à différents points-clés.

1.1.1. AUTOMATISATION

La prise en compte des attentes de l’utilisateur final d’un produit doit être une priorité dans le développement d’un outil. Dans le cas d’un outil d’analyse haut-débit, il est nécessaire de simplifier l’utilisation au maximum, non seulement pour diminuer la durée de mise en œuvre par l’opérateur, mais aussi et surtout afin de réduire au maximum les risques d’erreur liés à la manipulation par un opérateur. Dans le but de surmonter ce problème, le système d’analyse sur puce proposé ici permet une automatisation quasi-totale du procédé. En effet, les plaques 96-puits classiques sont traitées par un robot pipeteur EVO75, permettant la mise en œuvre de l’intégralité du protocole d’immunoessai sans intervention de l’utilisateur. Le robot, équipé d'un bras articulé, déplace la plaque 96-puits, remplit les puits des solutions choisies et contrôle les temps d’incubation selon les informations transmises par un programme. Cet appareillage et les procédés liés à son utilisation sont décrits en détails page 147 dans le paragraphe 2.7.1.

1.1.2. ANALYSE MULTIPARAMETRIQUE

Les standards d’analyse immunologique utilisés à l’heure actuelle sont les tests de type ELISA. Ces tests dédiés à de nombreuses applications, permettent la détection d’une molécule cible par essai. Ces tests monoparamétriques ont prouvé leur utilité mais gagneraient à être améliorés, notamment par

l’augmentation du nombre de molécules cibles analysées. En effet, un diagnostic précis requiert très souvent des informations concernant plusieurs paramètres en même temps. En cela, les biopuces représentent une avancée considérable. L’immobilisation de plusieurs sondes dans chaque puits, rendue possible grâce à un système de dépôt automatisé de très faibles volumes, permet l’analyse simultanée d’un nombre important de paramètres. Cette analyse multiparamétrique présente de nombreux autres avantages, liés aux réductions des volumes d’échantillons nécessaires (moins de sang à prélever par exemple), des volumes des substrats, des durées de manipulations et donc des coûts.

1.2. C

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Les puces ont été préparées sur un support de plaques 96-puits dont le fond est constitué d’une membrane de nitrocellulose et ester de cellulose (Multiscreen HTS-HA, Millipore). Ce choix a été effectué sur la base d’études préliminaires réalisées au laboratoire. Différents supports ont été testés, tels que des supports plastiques ou des polymères élastomériques (polydiméthylsiloxane) (Heyries et al. 2008)et il est apparu que le type de membranes utilisé dans notre étude offre la meilleure reproductibilité lors du dépôt des protéines, de la reconnaissance antigène/anticorps et de la détection. La porosité des membranes permet une immobilisation des sondes sur une surface spécifique très élevée, générant une augmentation de la densité de protéines par plot, et donc des performances accrues de la puce. De plus, ce support permet l’utilisation d’un protocole entièrement automatisé, et le traitement simultané de nombreux échantillons grâce au format standard de ces plaques couramment utilisées pour les tests de routine. Ceci permet un gain de temps et de coût, mais aussi une meilleure reproductibilité du test. Ce format permet de plus un dépôt des protéines sondes sur la surface externe des membranes, ce qui est un avantage technique par rapport à une immobilisation en fond de puits, mais aussi pour la lecture des résultats. Ce format de membranes en fond de puits permet également une filtration des échantillons et des différentes solutions à travers celles-ci par application d’un vide (McBride et al. 2008). Ce procédé permet de concentrer les solutions dans la membrane, et d’obtenir ainsi un signal spécifique important sur les plots, mais aussi de minimiser le bruit de fond sur la face extérieure en retenant les possibles contaminants à l’intérieur du puits (Figure 5-1).

Intérieur des puits Extérieur des puits

Figure 5-1. Images des membranes sur les deux faces de la plaque 96-puits

Le signal colorimétrique obtenu dans le fond des puits est très important et non-spécifique, tandis que la face externe des membranes, modifiée par la matrice de plots, présente un signal spécifique important sur les plots et peu de bruit de fond.

1.2.2. CHOIX DE LA METHODE DE DETECTION

Dans le but de produire un outil simple, peu coûteux mais performant, une détection des interactions par génération d’un signal colorimétrique semble être la méthode la plus adaptée. La génération d’un signal coloré visible à l’œil nu est facilement mise en œuvre par à un couplage des anticorps secondaire à une enzyme : la phosphatase alcaline. La génération du signal prend place dans le protocole robotisé, grâce à l’incubation d’un substrat chromogène sur les membranes. La phosphatase alcaline catalyse alors la transformation du substrat, une solution commerciale de BCIP/NBT de couleur jaune pale, en un précipité violet qui reste ancré dans la membrane à la position exacte à laquelle il est généré, associé donc à la position d’un plot. Détectable à la surface des membranes à la position d’un plot donné, ce signal témoigne donc de l’interaction sonde antigénique/anticorps cible/anticorps secondaire. L’apparition de ce précipité observable directement après incubation et pour des puits différents réduit les risques d’erreurs pour le traitement des données obtenues : les résultats pour un échantillon sont réunis sur une membrane clairement identifiable, et les plots colorés attestent de la réussite du protocole. L’image de la face inférieure des membranes étant acquise par un scanner de bureau classique, et traitée informatiquement à l’aide de logiciels simples d’utilisation, les coûts sont encore réduits par rapport à d’autres méthodes nécessitant un matériel plus spécifique, et ces procédés sont suffisamment faciles à mettre en œuvre pour que ces puces soient utilisées à grande échelle. Un autre avantage, lié à ces méthodes d’analyse des résultats, consiste en la possibilité de les sauvegarder facilement par informatique, ce qui permet un meilleur suivi du patient.