PREPARATION DES PUCES PAR DEPOT AUTOMATISE DE FAIBLES VOLUMES

2.3.1. PRINCIPE GENERAL

Afin de générer des matrices de plots en fond de puits de plaque 96-puits (fond de puits membranaires ou adhésif), un automate de dépôt non contact a été utilisé. Cet appareil utilise une technique de dépôt basée sur des impulsions électriques administrées à un cristal piézoélectrique, permettant l’éjection de gouttes de volume très faible (quelques centaines de picolitres) à des coordonnées x, y et z prédéfinies avec une précision de 5 μm. Il est ainsi possible d’obtenir des plots uniformes et réguliers, correspondant à un volume précis. L’ensemble du processus est contrôlé informatiquement, un logiciel contrôle les positions, les volumes prélevés et déposés, la forme de la matrice désirée etc. Dans un premier temps, la solution de dépôt est prélevée par un capillaire en verre. Le bras articulé de l’automate permet ensuite le déplacement du capillaire jusqu’à le positionner devant une caméra (dans le cas du SciFlex Arrayer S3), afin de contrôler la forme et la direction des gouttes éjectées. Si la goutte est valide, le capillaire est déplacé à la position préenregistrée dans le logiciel de contrôle, correspondant à la position du premier plot. Le dépôt est effectué et le capillaire est ensuite déplacé à la position du plot suivant pour procéder au second dépôt, et ainsi de suite pour toutes les positions désirées pour cette solution. Plusieurs cycles de lavage du capillaire sont ensuite effectués avant qu’une nouvelle solution ne soit prélevée et que l’automate n’opère un nouveau cycle de dépôts.

Les réglages (nombre de gouttes ou volume, écartement entre les plots, taille et disposition de la matrice de plots) sont optimisés pour les différentes applications traitées, ceux-ci seront donc explicités ci-après dans chacune des parties correspondantes.

Le dépôt est réalisé soit sur plaque 96-puits à fond membranaire, sur la face extérieure des membranes, soit sur un adhésif qui est ensuite assemblé à une plaque 96-puits sans fond (Figure 4-3).

Deux automates ont permis la réalisation des puces.

BioChip Arrayer BCA1 (Perkin-Elmer)

Cet automate est le plus ancien, il est utilisé pour la réalisation des puces d’allergènes et de TAA. Quatre micro-capillaires indépendants sont utilisés, permettant le dépôt de quatre solutions simultanément. Le volume d’une goutte est de 300 pL. Les étapes de prélèvement et éjection sont contrôlées à l’aide d’un capteur de pression. La forme de la goutte et la vitesse d’éjection peuvent être modifiées en ajustant les paramètres de l’impulsion piézoélectrique.

SciFlex Arrayer S3 (Scienion)

Cet automate, plus récent, a été utilisé pour la réalisation des puces de polluants. Un seul capillaire est utilisé, et les solutions sont déposées les unes après les autres. Les paramètres de l’impulsion piézoélectriques sont ici aussi optimisés, et la forme et la vitesse d’éjection de la goutte sont contrôlées à l’aide d’une caméra avant et après chaque cycle de dépôt. Cet appareillage permet donc un meilleur contrôle par l’utilisateur, mais il est aussi caractérisé par une plus grande vitesse de réalisation des procédés, ainsi que par une précision améliorée.

2.3.2. PREPARATION D’UNE PUCE POUR LA DETECTION D’ALLERGENES

Le dépôt des allergènes a été réalisé sur la face extérieure des membranes composant le fond des puits, avec l’automate BCA1 précédemment décrit. Le volume a été optimisé à 2,4 nL par plot (chaque goutte contenant 300 pL de solution, 8 gouttes ont été déposées) et avec une distance entre les plots de 500 μm. Pour les tests effectués, les solutions d’allergènes ont été utilisées à des concentrations arbitraires, maximales par rapport aux solutions stocks reçues, et différentes pour chacune d’entre elles (de 18 μg/mL à 1,86 mg/mL). Ceci ne faussera pas l’interprétation des résultats puisqu’ils seront normalisés de façon à être comparés allergène par allergène. 12 protéines sondes ont été déposées sur les membranes sous la forme d’une matrice de 26 plots (Figure 4-4) : 8 protéines recombinantes et 2 extraits correspondant aux allergènes (2 réplicats) ainsi que 2 contrôles (une solution d’IgE de référence et une solution d’IgE marquées par la phosphatase alcaline) (3 réplicats).

2.3.3. PREPARATION D’UNE PUCE POUR LA DETECTION DE BIOMARQUEURS DE CANCER

Le dépôt des sondes a été réalisé sur la face extérieure des membranes composant le fond des puits, avec l’automate BCA1 précédemment décrit. Le dépôt a été réalisé avec un volume optimisé de 2,4 nL par plot (8 gouttes de 300 pL), avec une distance entre les plots de 500 μm. Les différents antigènes ont été déposés en solution dans du PBS contenant 1 mg/mL de bleu de bromophénol. 15 protéines sondes ont été déposées en 3 réplicats sur les membranes, composant une matrice de 45 plots (Figure 4-5) : 12 antigènes associés aux tumeurs et 3 contrôles (IgG humain, anti-IgG de lapin couplé à la phosphatase alcaline, albumine de sérum bovin).

Figure 4-5. Matrice des sondes d’antigènes associés aux tumeurs

2.3.4. PREPARATION D’UNE PUCE POUR LE CONTROLE DE LA QUALITE DE L’EAU

Le dépôt des sondes a été réalisé sur de l’adhésif sensible à la pression, avec l’automate SciFlex S3 précédemment décrit. Les solutions de conjugués ont été utilisées dans du tampon acétate KCl, contenant 0,5 mg/mL de bleu de bromophénol comme contrôle de dépôt. 0,8 nL de chaque solution a été déposé avec un écart de 450 μm entre les plots, en une matrice de 49 plots (7x7).

Pour la première partie de l’étude (Figure 4-6 matrice I), concernant le criblage des conjugués et les tests de sélectivité, tous les conjugués ont été déposés en 2 réplicats, avec le contrôle positif en 3 réplicats (streptavidine marquée par la phosphatase alcaline) et les sept contrôle d’interaction non-spécifique en 3 réplicats également (BSA-4-BBA, latex-4-BBA, dextran-4-BBA, BSA, latex, dextran et bleu de bromophénol).

Pour la seconde partie de l’étude (Figure 4-6 matrice II), concernant la calibration du test, et la détection multiplexe de polluants, la matrice a été composée de cinq réplicats des conjugués choisis, un pour chaque polluant, de trois réplicats du contrôle positif et de trois réplicats pour les sept contrôles des interactions non-spécifiques. Le support adhésif a ensuite été directement assemblé avec une plaque 96-puits sans fond, comme décrit à la Figure 4-3.

Figure 4-6. Matrice des sondes de polluants

2.4. PREPARATION DES PUCES PAR SERIGRAPHIE

2.4.1. PRINCIPE GENERAL

La sérigraphie est un procédé d’impression utilisant un masque constitué d’un maillage qui laisse passer l’encre déposée à l’aide d’une raclette selon un motif précis. Ce processus est capable d’imprimer sur de nombreuses matières : papiers, tissus, plastiques, métaux, verres, céramiques etc. Au laboratoire, et dans le cadre de cette thèse, l’appareil DEK 248 est utilisé pour la sérigraphie d’électrodes de carbone sur du plastique de polycarbonate transparent, ou sur du papier. Différents masques, tissés de fibres de polyester mono-filament, d'une taille de maille de 0,1 mm (260 ppp), et d'une épaisseur de 13 ʅŵƐŽŶƚ utilisés, correspondant aux différents motifs à produire. Lors du processus de sérigraphie, le support à imprimer est placé en contact avec le masque, et la raclette de polyuréthane est déplacée le long du masque avec une pression appliquée prédéfinie, de façon à ce que l’encre soit poussée au travers des motifs sur le support (voir Figure 4-7). L’écartement entre le support et le masque, la pression appliquée sur la raclette, le nombre et la vitesse des passages de la raclette sur le support ainsi que la vitesse de séparation entre le support et le masque sont des paramètres à contrôler et à optimiser afin d’obtenir les caractéristiques recherchées pour les puces.

Lors de la préparation des puces par sérigraphie, plusieurs étapes sont suivies. La première consiste en la vérification des réglages, et notamment en l’alignement du support avec la zone à motifs du masque. Le premier type d’encre déposé est une encre de carbone (Electrodag 423 SS), composée de particules de graphite d'environ 1 ʅŵ ĚĞ ĚŝĂŵètre, dispersées dans un polymère conducteur thermosensible. Les supports sont placés à l'étuve (100°C, 10 minutes) directement après impression afin de permettre la polymérisation et le séchage de l'encre. Pour les puces sérigraphiées sur support de polycarbonate, une couche de vernis hydrophobe isolant (Minico M7000) est ensuite déposée à l'aide d'un second masque, par-dessus les électrodes de carbone. Pour cela, l’alignement des puces de carbone avec le masque « vernis isolant » est réalisé à l’aide d’un système de caméras, assisté par ordinateur à l’aide du logiciel Dek Align 4. Après impression, les supports sont une nouvelle fois cuits afin de permettre la polymérisation et le séchage du vernis isolant.

2.4.2. SERIGRAPHIE SUR POLYCARBONATE POUR LA DETECTION DE PRECURSEURS D’EXPLOSIFS

La sérigraphie des puces pour la détection de précurseurs d’explosifs a été réalisée sur des supports de polycarbonate transparents, selon un motif présenté Figure 4-8. Elles sont constituées de 8 électrodes de travail d’un diamètre de 0,6 mm, et d’une contre électrode centrale, faisant face à une pseudo-référence. L’impression d’un vernis isolant permet la délimitation d’une zone de travail et de mesure, susceptible d’être recouverte par une goutte d’un volume de 35 μL. Ces puces ont été ensuite modifiées par électrodépôt de métaux (décrits dans le paragraphe 2.5.1 page 144).

Figure 4-8. Préparation de la puce de polycarbonate pour la détection de précurseurs d’explosifs

2.4.3. SERIGRAPHIE SUR PAPIER POUR L’IMMUNODETECTION DE POLLUANTS

La sérigraphie du troisième type de puces pour l’immunodétection de polluants a été réalisée sur un support papier, selon le motif présenté sur la Figure 4-9. Elles sont constituées d’une électrode de travail, entourée d’une contre électrode faisant également office de pseudo-référence.

Figure 4-9. Préparation de la puce sur papier pour la détection de polluants

2.5. MODIFICATION DES PUCES SERIGRAPHIEES

2.5.1. ELECTRODEPOSITION DE METAUX ET ASSEMBLAGE DE LA PUCE

Quatre des huit électrodes de travail des puces ont été modifiées (Figure 4-10) dans le but de générer différentes surfaces pour les mesures électrochimiques. Trois métaux ont été électrodéposés indépendamment par chronopotentiométrie en mode galvanostatique, où un courant constant a été appliqué pendant 10 minutes, conduisant à une charge fixe, optimisée pour chaque type de métal. En pratique, une goutte de 40 μL de solution a été déposée sur la zone de travail. Les dépôts de palladium

et d’or ont été réalisés avec un courant fixé à -30 μA, en présence d’une solution de HAuCl4 ou Pd(OAc)2

à une concentration de 10 mM, dans HCl à 0,1 M. Un courant de -15 μA a été appliqué pour le dépôt de

platine, en présence d’une solution de H2PtCl6 à une concentration de 10 mM dans HCl 0,1 M. Enfin, un

courant de -15 μA a été appliqué à une électrode de carbone nue, dans une solution de HCl 0,1 M. A la suite de chaque électrodépôt, les puces sérigraphiées ont été rincées par de l’eau milliQ.

Figure 4-10. Modification de la puce

A.Puce sérigraphiée sur polycarbonate B. Electrodépôt de métaux : or, palladium et platine, sur trois des électrodes de travail, C. Création d’une chambre de mesure. Encart : photographie de la puce branchée au connecteur multi-voie

Une fois les électrodes de travail modifiées, une chambre de mesure a été créée grâce à l’assemblage de la puce avec une fenêtre de plastique de dimensions 15x15 mm percée d’un évent, à l’aide d’un adhésif

double face coupé en forme de U avec un appareil SilhouetteSD. Cet assemblage définit une chambre qui se remplit par capillarité avec un volume constant de 35 μL.

Dans le but de réaliser des mesures directement dans les tuyaux d’évacuation d’eaux usées, un outil complet a été imaginé, permettant d’assembler la puce électrochimique avec la canalisation et de lancer facilement la mesure. Cet outil est présenté sur la Figure 4-11.

Figure 4-11. Outil d’assemblage de la puce aux tuyaux d’évacuation

Le principe de l’utilisation de la puce sur site est présenté ici, en présence d’un flux de liquide dans les canalisations, la chambre de mesure de la puce se remplit avec un volume constant par capillarité. Encart : photographie du système

2.5.2. PREPARATION ET ASSEMBLAGE DE LA PUCE DE PAPIER

Pour ces puces sérigraphiées sur papier, qui permettent la diffusion des solutions par capillarité, la surface de travail n’est plus délimitée par du vernis isolant imprimé mais par un polymère de polydiméthyl siloxane (PDMS) (Figure 4-12) déposé après sérigraphie de la puce, puis cuit à 100°C pendant 10 minutes pour permettre la polymérisation et le séchage. Ce polymère pénètre dans les fibres du papier et sert de barrière au solvant, permettant ainsi de conserver la zone de connexion des électrodes isolée, tout en permettant une diffusion des réactifs dans la zone de travail de l’électrode. Un adhésif est ensuite utilisé de façon à délimiter une zone de dépôt centrale, permettant aussi la protection de l’électrode de carbone.