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3.2.1 Extração do DNA dos isolados

A extração de ácido nucléico das hifas do fungo foi feita segundo o protocolo proposto por Raeder e Broda (1985). A massa micelial foi produzida em 30 mL de meio líquido BD (20% de batata e 2% de dextrose) mantidos a 28ºC, sob agitação a 150 rpm por 3 dias, tendo como inóculo um disco de 1 cm de diâmetro de meio BDA contendo hifas do fungo.

O micélio produzido foi separado do meio de cultivo por filtração e lavado com água destilada para retirada de meio residual presente nas hifas. Na extração foi utilizado aproximadamente 0,3 g de micélio fresco que foi macerado com nitrogênio líquido em cadinhos de porcelana com o auxílio do pistilo. O macerado foi transferido para eppendorf de 2 mL e adicionou-se 500 µ L de tampão Tris-HCl (trishidroximetilaminometano 1M, pH 8), 50 µ L de SDS (sódio dodecil sulfato 10%) e 50 µ L de mercapto-etanol. Os eppendorfs foram incubados em banho-maria a 65ºC por 30 minutos e posteriormente centrifugou-se a 12000g por 30 minutos para em seguida realizar a coleta de 600 µL da fase líquida (sobrenadante) separada do resto celular em um novo eppendorf de 2 mL. A seguir foi realizada a desproteinização do

sobrenadante com adição de 800 µL de clorofil (24clorofórmio: 25fenol: 1álcool isoamílico) e as amostras foram então homogeneizadas e centrifugadas a 12000g por 5 minutos. Após a centrifugação formou-se um sistema bifásico e 400 µL da fase aquosa superior foi coletada e transferida para um novo eppendorf de 2 mL. Uma nova desproteinização foi realizada na fase aquosa adicionando-se 800 µL de CIA gelado (clorofórmio, álcool isoamílico) na proporção 24:1, com posterior homogeneização e centrifugação a 12000g por 5 minutos. Após centrifugação recolheu-se a fase superior da qual o DNA foi precipitado.

O DNA foi precipitado adicionando-se o mesmo volume de iso-propanol absoluto gelado e mantendo as amostras em banho de gelo (0ºC) por 5 minutos. O DNA precipitado foi centrifugado a 12000g por 5 minutos e a fase líquida descartada. O precipitado visualizado no fundo do eppendorf foi lavado com 500 µL de etanol 70% gelado. A solução de etanol foi descartada e o DNA foi mantido em condição ambiente para eliminação de etanol residual. O DNA extraído foi então ressuspendido em 50 µL de água destilada esterilizada. A integridade do DNA isolado foi verificada após eletroforese com tampão Tris-Borato-EDTA (89 mM Tris Base, 89 mM Ácido Bórico, 20 mM EDTA, pH 8), à 50mV por 1 hora de 5 µL da solução de DNA e 3 µ L tampão de peso em gel de agarose 1%, utilizando Brometo de Etídio (0,5 µ g/mL) como revelador.

3.2.2 Amplificação do DNA via reação em cadeia da polimerase (PCR)

O fragmento da região do gene rDNA 26S de cada isolado foi realizada com o DNA extraído. A reação de PCR para amplificação da região rDNA 26S foi realizada em solução contendo: 25 ng de DNA, 1,5 mM de MgCl2, 100 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada primer e 1,5 U de Taq DNA polimerase em um volume final de 50 µ L com água deionizada esterilizada. A reação foi realizada nas seguintes condições: uma desnaturação inicial de 94ºC durante 5 minutos, seguida de um ciclo com uma primeira etapa de desnaturação a 94ºC por 1 minuto e uma segunda etapa de anelamento a 55ºC durante 1 minuto e finalizando com terceira etapa de extensão de 72ºC durante 1 minuto; este ciclo se repete por 35 vezes. Ao final da ciclagem houve uma etapa de extensão final de 72ºC durante 7 minutos. As reações foram conduzidas no termociclador modelo GeneAmp 9600 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os iniciadores

GCCATATCAATAAGCGGAGGAAAG-3’) amplificam fragmentos de 600 pares de bases (KURTZMAN; ROBNETT, 1998; LEAL Jr et al., 2008).

Os fragmentos produzidos foram visualizados após eletroforese do volume total da reação com tampão Tris-Borato-EDTA (89 mM Tris Base, 89 mM Ácido Bórico, 20 mM EDTA, pH 8), à 50 mV por 1 hora em gel de agarose 1%, utilizando Brometo de Etídio (0,5 µg/mL) como revelador.

3.2.3 Purificação e quantificação do produto de PCR para reação de seqüenciamento

Após certificar-se dos fragmentos desejados produzidos pela reação de PCR uma nova reação foi conduzida para obtenção de material para o seqüenciamento. Antes de seguir para o seqüenciamento o produto de PCR obtido da reação foi purificado para eliminação de nucleotídeos, enzimas e iniciadores que pudessem interferir na reação do seqüenciamento. Na reação de PCR obtido da reação de 50 µL o fragmento de DNA amplificado foi precipitado adicionando 100 µ L de isopropanol 65%, gelado, incubado à -4ºC por 1 hora, e posteriormente homogeneizado. O DNA foi recuperado após centrifugação a 12000g por 20 minutos e a fase alcoólica foi descartada. O fragmento de DNA precipitado foi lavado com 100 µ L de etanol 70%, gelado e recuperado após centrifugação a 12000g por 12 minutos, com posterior descarte do etanol 70%. Após evaporação do etanol residual em condição ambiente, o precipitado foi ressuspendido em 30 µL de água deionizada esterilizada. O fragmento purificado foi visualizado após eletroforese de 5 µL da solução de DNA purificada, à 50 mV por 1 hora, em gel de agarose 1% e utilizando Brometo de Etídio (0,5 µg/mL) como revelador. A quantificação do produto de PCR foi determinada por espectrofotometria, segundo Maniatis et al. (1982).

3.2.4 Seqüenciamento e análise das seqüências

Os produtos da amplificação do gene 26S rDNA foram seqüenciados no Laboratório de Genômica e Biologia Molecular de Plantas do Departamento de Ciências Biológicas da

Universidade de São Paulo (CBTEC/USP). A reação de seqüenciamento de DNA foi realizada

com 2 µ L (aproximadamente 60 ng de DNA) dos produtos amplificados e purificados. O oligonucleotídeo iniciador utilizado para a reação foi o NL1. O seqüenciamento foi realizado utilizando o protocolo padrão do Kit DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing (Amersham

Biosciences). O seqüenciador utilizado foi o ABI Prisma-3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

As seqüências foram analisadas através do software Chromas Lite versão 2.01. Os cromatogramas obtidos foram examinados para verificação da qualidade utilizando o programa BioEdit Sequence Alignment Editor versão 7.0.9.0 (HALL, 1999). A identificação dos fungos foi realizada através da utilização da ferramenta BLAST (Nacional Center for Biotechnology Information). As seqüências obtidas foram comparadas com as seqüências depositadas no banco de dados público GeneBank do NCBI para a certificação da região amplificada. O alinhamento foi realizado no programa MEGA versão 4 (TAMURA et al., 2007).