SUR AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS
INTRODUCTION
Compte tenu de l’incidence élevée des parodontites agressives au Maroc liée une souche hautement virulente d’Aggregatibacter actinomycetemcomitans (clone JP2 du sérotype b), et vu la résistance croissante des bactéries orales aux antibiotiques et des effects secondaires provoquées par les agents antiseptiques souvent utilisée en dentisterie (colorations dentaires, altération du goût…), la recherche d’un nouvel agent d’origine naturelle comme alternative thérapeutique, entraînant moins d’effets secondaires et moins de résistances bactériennes est devenu une nécessité.
Le Maroc, par sa diversité géographique, possède de grandes ressources naturelles en plantes médicinales et aromatiques, et figure parmi les principaux pays producteurs d’huiles essentielles. Des enquêtes réalisées au Maroc auprès de la population dans différentes régions (voir Partie I, chapitre I) ont mis en évidence un usage thérapeutique fréquent de ce patrimoine naturel en Médecine traditionnelle.
Aujourd’hui, des recherches et des études, en continuelle augmentation, sont menées à travers le monde afin de connaître leurs différentes propriétés médicinales et pharmacologiques, et ce dans le but de pouvoir les intégrer dans l’arsenal thérapeutique, selon des normes de qualité et d’efficacité.
Cependant, les travaux sur l’apport des plantes médicinales et des huiles essentielles en dentisterie demeurent peu nombreux et leurs activités antimicrobiennes sur les bactéries orales sont peu étudiées. En effet, notre étude systématique portant sur l’effet des huiles essentielles sur Aggregatibacter actinomycetemcomitans a bien mis en évidence cette insuffisance.
Pour toutes ces raisons, nous avons mené une recherche sur l’évaluation de l’activité antibactérienne de certaines huiles essentielles d’origine Marocaine sur Aggregatibacter actinomycetemcomitans, souche connue virulente dans le contexte Marocain, puisque
fortement incriminée dans les parodontites agressives, réel problème de santé publique dans notre pays.
MATERIEL ET METHODES
1. Matériel
1.1. Huiles essentielles :
Fournies par l’Institut National des Plantes Médicinales et Aromatiques (INPMA) de
Taounate, Maroc (tableau 3). Il s’agit de :
-
L’huile essentielle de Menthe pouliot (Fig 22)-
L’huile essentielle de Bigaradier (Fig 23)-
L’huile essentielle de Citronnelle (Fig 24)-
L’huile essentielle de Thym (Fig 25)-
L’huile essentielle d’Origan (Fig 26)-
L’huile essentielle de Palma rosa (Fig 27)Ces huiles ont été extraites de plantes qui ont été cultivées au Maroc, choisis en fonction des effets antimicrobiens connus et documentés et / ou de l'utilisation anecdotique chez les marocains (tableau 3).
L'identification botanique a été faite par Prof. Farah Abdellah et les spécimens authentifiés ont été déposés dans l'herbier de laboratoire de photochimie de l'Institut national de plantes médicinales et aromatiques - Université de Sidi Mohamed Ben Abdellah, Fès, Maroc. Les codes ont été fournis à différents échantillons: Mentha pulegium L. (code: FA/RP/INPMA/104), Cymbopogon citratus (code: FA/RP/INPMA/105), Citrus aurantium L. (code: FA / RP / INPMA/106), Thymus vulgaris (code: FA / RP / INPMA/108), Origanum compactum (code: FA / RP / INPMA/107), Cymbopogon martinii (code: FA / RP / INPMA/109).
Fig 22 : Menthe pouliot Fig 23 : Bigaradier
Fig 24 : Citronnelle Fig 25 : Thym
Nom commun Nom local Nom scientifique Famille Partie utilisée Propriétés médicinales Menthe pouliot Fliyo Mentha pulegium L. Lamiaceae Partie aéérienne Antiseptique pulmonaire, expectorant, antispasmodique, stomachique, rafraîchissant (31)
Citronnelle Leimoun Cymbopogon citratus
Poaceae Partie aéérienne
Insectifuge (304), antiseptique (31) Bigaradier Narendj Citrus
aurantium L. Rutaceae Partie aéérienne (Fleurs) Anti infectieux, inotrope (31) Sédatif et anxiolytique (305, 306)
Thym Zîitra Thymus
vulgaris Lamiaceae Partie aéérienne Antiseptique intestinal et pulmonaire, expectorant, diurétique, stomachique, vermifuge, antispasmodique (31).
Origan Zaâtar Origanum
compactum Lamiaceae Partie aéérienne Antiseptique intestinal, diurétique, antiacide, stomachique, antispasmodique (31). Palmarosa Palmarosa Cymbopogon
martinii Poaceae Partie aéérienne Insectifuge (307), vermifuge (308), antifongique (309)
En raison de la faible hydrosolubilité des huiles essentielles, des émulsifiants tels que le Tween 80 sont souvent utilisés pour augmenter la solubilité des composés hydrophobes dans les milieux solides ou liquides (310).
Ainsi, une solution mère de travail de ces huiles essentielles émulsifiées dans du Tween 80 à 10% est préparée selon le protocole de Benjilali et al. 1986 (311).
1.2. Souches bactériennes
L’activité antimicrobienne des huiles essentielles a été évaluée sur 2 souches bactériennes d’Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa). Il s’agit :
* D’une souche Aa isolat clinique ; sérotype b, clone JP2 (Fig 28) : issue de prélèvements de plaque sous-gingivale de patients atteints de parodontite agressive, au Service de Parodontologie du Centre de Consultation et de traitement dentaire de Rabat. Elle a été isolée et lyophilisée par Prof. Akihiro Yoshida de Kyushu Dental University au Japon.
* Une souche Aa de référence; sérotype b, clone non-JP2 (Fig 29) : CIP 101032 de l’Institut Pasteur à Paris, France.
Fig 28 : Souche marocaine Aa isolat clinique lyophilisée
Ces souches ont été mises en culture dans des milieux de culture nutritifs à 37°C sous 5% de CO2 (Fig 30) dans des jarres (Fig 31) à l’intérieur d’une étuve (Fig 32), puis ont été conservées à une température de -20°C et -80°C dans des milieux de conservation (Fig 33).
Fig 29: Souche Aa de référence ; sérotype b, clone non-JP2 de l’Institut Pasteur, Paris, France
Fig 30 : Générateur de CO2 à 5%
1.3 Milieux de culture :
La culture des bactéries a nécessité l’utilisation des milieux suivants : la gélose Brain Heart Infusion (BHI) Agar (Fig 34), gélose au sang cuit ou chocolat Polyvitex (Oxoid Deutschland Gmbh, Postfach, Wesel) (Fig 35) et un bouillon nutritif à base de Brain Heart Infusion (BHI) et extrait de levure (1%) (Fig 36).
L’aspect des colonies après mise en culture des souches lyophilisées de Aa isolat clinique (Fig 37) et Aa référence est illustré sur gélose de sang cuit (Fig 38).
Fig 33 : Milieu de conservation de souches Fig 32 : Etuve (Laboratoire de
Recherche et Biosécurité P3- Hôpital militaire et d’instruction Mohammed
Fig 35 : Gélose au sang cuit ou chocolat Polyvitex (Oxoid
Deutschland Gmbh, Postfach, Wesel) Fig 34 : Géloses Brain Heart Infusion
(BHI) Agar coulées dans des boîtes de pétri (Laboratoire de Bactériologie-
Hôpital militaire et d’instruction Mohammed V
Fig 36 : Bouillon nutritif préparé à base de Brain Heart Infusion (BHI) et extrait de levure (Laboratoire de
Recherche et Biosécurité P3- Hôpital militaire et d’instruction Mohammed V, Rabat)
1.4 Antibiotiques :
Les antibiotiques suivants ont été utilisés comme produits contrôles (contrôle positive) dans notre étude :
Doxycycline (DO) : sous forme de disque de 30 µg pour la méthode de diffusion en milieu solide (gélosé) (Fig 39).
Amoxicilline : en solution préparée à la concentration de 10 mg/ml pour la méthode de diffusion en milieu liquide.
Fig 39 : Antibiotique (Doxycycline) en disque de 30 µg
Fig 37 : Aspect des colonies de Aa isolat clinique après 48h de
mise en culture
Fig 38 : Aspect des colonies de Aa référence après 48h de mise
2. Méthode expérimentale :
2.1. Extraction des huiles essentielles
Une portion (100 g) des parties aériennes des plantes a été hydrodistillée, pendant au moins trois heures, en utilisant un appareil de type Clevenger. Pour éliminer toute trace d'eau, l'huile extraite a été traitée avec du sulfate de sodium anhydre (Na2SO4), filtrée et ensuite stockée à l'obscurité à 4 ° C. Le rendement en huiles essentielles a été exprimé en ml/100 g de matière sèche.
2.2. Analyse chromatographique et caractérisation des huiles essentielles
GC : analyse par CG est effectuée sur un chromatographe Hewlett -Packard ( HP 6890 ) gazeuse ( FID) , équipé d'une colonne capillaire HP- 5 (5% de phényl méthyl silicone ) . La caractéristique de cette colonne était de: 30 m de longueur, 0,25 mm de diamètre et de 0,25 m d'épaisseur de film. La température est programmée de 50 ° C (5min d'attente initiale) à 200 ° C à 4 ° C / min . Des conditions de chromatographie en phase gazeuse ont été les suivantes : N2 comme gaz porteur (1,8 ml / min) ; mode partagé (débit: 72,1 ml / min , le rapport : 1/50 ) a été utilisée , les températures de l'injecteur et le détecteur sont de 275 ° C et 250 ° C respectivement . Les échantillons dilués (1/20 dans l'hexane) de 1 l ont été injectés manuellement. La machine a été dirigée par un type de système informatique « HP ChemStation ».
GC / MS : La composition chimique des huiles essentielles ont été analysées en utilisant un chromatographe en phase gazeuse (GC Ultra TRACE ) monté sur un spectromètre de masse (Polaris Q-Ion Trap MS). Fonctionnement en mode impact électronique d'assurance-emploi (70 eV). VB- 5 ( méthylpolysiloxane 5% phényle ) et une colonne ( 30m x 0,25 mm x épaisseur de 0,25 pm ) ont été utilisés (Centre national de la recherche scientifique et technique - ( CNRST ) , Rabat , Maroc ) . Les conditions chromatographiques sont les suivantes: températures de l’injecteur et du détecteur à 220 et 300 ° C respectivement; gaz porteur, de l'hélium à un débit de 1,4 ml / min, température de programme rampe de 40 à 300 ° C avec un gradient de 4 ° C / min (maintien de la température initiale et finale pendant 4min). La quantité relative des composants individuels de l'huile totale a été exprimée en pourcentage d’aire du pic par rapport à la zone de pic totale. Une recherche bibliographique a
composants des huiles ont également été identifiés par leurs indices de rétention relatifs à n-alcanes (C8 - C24).
2.3. Etude de l’activité antimicrobienne in vitro des huiles essentielles
Tous les essais in vitro de recherche de l’activité antimicrobienne des huiles essentielles Marocaines testées ont été réalisés au Laboratoire de Recherche et Biosécurité P3- Hôpital militaire et d’instruction Mohammed V, Rabat.
L’activité antibactérienne des huiles essentielles sur les souches d’Aggregatibacter actinomycetemcomitans est réalisée, en 1er temps, par la technique de contact direct par diffusion en milieu gélosé, qui permet de prévoir l’efficacité in vitro de l’huile essentielle. Cette méthode servira ainsi à la présélection des huiles essentielles ayant une activité antimicrobienne effective.
Ensuite, pour le calcul de la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) de ces huiles testées efficaces, la méthode de microdilution sur microplaque de 96 puits est utilisée dans notre étude. Enfin, la CMB (Concentration Minimale Bactéricide) est également mesurée suivant le protocole ci-après.
2.3.1. Méthode de diffusion en puits
Ce test est réalisé par dépôt de l’huile essentielle dans des puits creusés dans la gélose. Elle assure une diffusion totale de l'H.E. à partir d'un puits en donnant une zone d'inhibition claire et de diamètre facilement mesurable sur gélose ensemencée par la suspension bactérienne selon la technique de DORMAN et DEANS 2000 (127).
Préparation de l’inoculum
A partir de souches conservées à -20°C (sous formes de billes), une mise en culture est réalisée sur gélose au sang cuit en condition d’anaérobiose sous 5% de CO2 à 37°C pendant 24h. Une suspension bactérienne d’une densité de 0.5 Mc Farland est ensuite préparée à partir de cette culture pure et jeune (âgée de 24 heures) (Fig 40) dans une solution de 0,85% Nacl (Fig 41), en utilisant un étalon (Fig 14). La suspension ajustée devra ainsi contenir approximativement 108 CFU/ml (colony forming units /ml).
Il est à signaler que l’inoculum ainsi préparé ne doit pas être utilisé au delà de 30 minutes au risque d’une augmentation de la densité de l’inoculum à cause de la croissance bactérienne.
Ensemencement des boîtes de pétri :
L’inoculum préparé est ensemencé en surface du milieu gélosé par inondation. Après 15 min, des puits de 6mm sont creusés (Fig 42).
Ensuite, l'huile essentielle est versée dans chaque puits. On teste l’huile essentielle pure et
Fig 41 : Solution de Nacl pour préparation de suspension bactérienne et étalon de 0,5 Mc
Farland
Fig 42 : Gélose de sang cuit ensemencée par inondation d’inoculum bactérien avec un puits
creusé au centre Fig 40 : Aspect des colonies de Aa après
24h de mise en culture (à partir de billes conservées à -20°C)
La doxycycline en disque de 30ug est utilisée comme contrôle positif, Tween 80 pur et dilué à 10% sont utilisés comme contrôle négatif. Une boîte de pétri ensemencée par inondation a été prise comme témoin de croissance bactérienne (Fig 26). Tous les tests ont été effectués en triplicata.
Incubation
Les boîtes de pétri ensemencées sont incubées à l’étuve à 37°C, dans des jarres, sous 5% de CO2, pendant 48h.
2.3.2 Méthode de microdilution
La détermination de la concentration minimale inhibitrice des huiles testées sur l’Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) est réalisée sur microplaque à 96 puits de culture cellulaire (Fig 43) selon une modification de la méthode décrite par Shapiro et al. (272) et Carson et al. (131).
A partir de colonies de Aa des 2 souches (isolat et souche de référence) datant de 48h (Fig 44), on inocule 2 tubes contenant BHI (Brain Heart Infusion) stérile. Après24h d’incubation à 37°C dans une jarre sous 5% de CO2, on ajuste la densité à 0.5 Mc Farland.
Parallèlement, des dilutions en série successives par progression géométrique de raison 2 de la solution mère obtenue pour chaque huile essentielle testée sont préparées dans un milieu de culture stérile (BHI), de façon à obtenir successivement les dilutions : 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512. En prenant en compte la solution mère de base préparée de l’huile essentielle (10%), ces dilutions correspondent, par conséquent, à : 5%, 2,5%, 1,25%, 0,6%, 0,3%, 0,15%, 0,07%, 0,03%, 0,01% .
Ensuite, des aliquotes de 100 µl de chaque dilution préparée d’huile testée ont été ajoutées, dans chaque puits de microplaque, à 100 µl d’inoculum préparé, et ce concernant les 2 souches de Aa.
Le Tween 80 à 10% est utilisé comme contrôle négatif. Un contrôle de croissance (inoculum seul) pour chaque souche a été inclus également dans l’essai. Pour chaque huile testée, les tests ont été effectués en triplicata sur la même microplaque et l’expérimentation a été répétée 2 fois. Le schéma de la distribution expérimentale au niveau des microplaques est illustré ci-après (Fig 46).
Concernant le contrôle positif : nous avons utilisé l’amoxicilline que nous avons préparé et dont nous avons déterminé la CMI sur les 2 souches de Aa en utilisant la méthode de microdilution dans un bouillon de culture adapté. En l’absence de méthode standardisée
Fig 44 : Colonies de Aa après 48h de mise en culture (à partir de billes
souche, nous avons adopté la procédure suivante en s’inspirant de celle des « entérobactéries » dans les recommandations de CLSI (312, 313):
Une suspension bactérienne en bouillon équivalente au standard McFarland 0,5 a été préparée et ajoutée aux solutions antibiotiques à différentes concentrations (0,01mg/ml, 0,1mg/ml, 1mg/ml, 10mg/ml). Un contrôle négatif (eau stérile + inoculum) est utilisé comme témoin de croissance bactérienne et une solution contenant du bouillon stérile est utilisée comme contrôle de contamination. Ainsi, la concentration de 10 mg/ml, dont la solution est restée claire (non trouble) (Fig 45) a été considérée comme la CMI de l’Amoxicilline qui sera utilisée comme contrôle positif dans notre essai sur les huiles essentielles.
Fig 45 : Essai de microdilution pour la détermination de la CMI de l’Amoxicilline testé à différentes concentrations (0,01mg/ml, 0,1mg/ml,
1mg/ml, 10mg/ml)
(la solution restant claire (à gauche) est considérée comme la CMI à 10mg/ml)
Les microplaques, recouvertes de leurs couvercles, ont été mises à l’étuve pour incubation dans des sachets en plastique sous 5% de CO2 (Fig 47), à 37°C pendant 48h.
C1 C1 C1 C1 C1 C1
C2 C2 C2 C2 C2 C2
C3 C3 C3 C3 C3 C3
C4 C4 C4 C4 C4 C4
C+ C- Cc Cc Cc Cc C- C+
Fig 46 : Distribution expérimentale de la microplaque pour chaque huile testée pour la détermination de la CMI
C1 C4 : différentes concentrations de l’huile testée + inoculum (Aa isolat clinique en rouge et Aa référence en vert), Cc : contrôle de croissance (inoculum seul), C- : contrôle négatif (tween 80 à 10% + inoculum), C+ : contrôle positif (Amoxicilline + inoculum)
Après la période d'incubation, une solution à 2 mg / mL de Triphényl Tétrazolium Chloride (TTC) (indicateur de croissance bactérienne) (314) (Fig 48) est ajoutée dans chaque puits et la plaque est incubée à 37 ° C. La solution d'indicateur TTC change du clair au pourpre en présence d’activité bactérienne, tandis qu’elle reste claire lorsque la croissance microbienne est inhibée. CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) est définie comme la plus faible concentration de l'huile essentielle qui ne montre aucune croissance bactérienne visible après la période d'incubation (pas de changement de couleur (claire) de TTC) (Fig 49).
Fig 47 : Mise en incubation des microplaques pour la détermination des CMI des huiles testées
a: les microplaques mises dans un sachet sous 5% de CO2 b : Le sachet contenant les microplaques est mis à l’étuve à 37°C
Pour déterminer la Concentration Minimale Bactéricide (CMB), une aliquote est prélevée à partir de cultures au niveau des puits ne présentant pas de turbidité visible, et ensemencée sur des milieux de gélose de sang cuit et incubée pendant 48h à 37 ° C sous 5% de CO2 (315). La détermination des valeurs de CMB a été réalisée en triplicata. Le rapport CMB / CMI a également été calculé pour mettre en évidence la nature de l'effet antibactérien des huiles essentielles testées. Lorsque le rapport est inférieur à 4, l'huile essentielle est considérée comme une huile essentielle bactéricide et lorsque le ratio est supérieur à 4, elle est considérée comme une huile essentielle bactériostatique (316).
2.4 Analyse statistique
Les diamètres des zones d’inhibition, variables continues avec distribution normale, ont été présentés en moyenne ± écart type. Pour les différences statistiques entre les sept groupes (Mentha pulegium, Cymbopogon citratus, Citrus aurantium, Thymus vulgaris, Origanum compactum, Cymbopogon martinii, Doxycycline), l’analyse à un facteur (ANOVA) avec correction Bonferroni a été effectuée. Les variables de Concentrations Minimales inhibitrices (CMI) (%) (v/v) ont été exprimées en médiane et interquartile, et celles concernant les
Fig 49 : changement de couleur au niveau des puits de la microplaque en présence d’activité bactérienne sous
l’effet de la solution TTC Fig 48 : Triphényl Tétrazolium
Chlorid (TTC) (Laboratoire de de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, UM5S-
présentées en moyenne ± écart type. La différence entre la souche Aa JP2 isolat clinique et la souche Aa de référence non JP2 a été testée par le test de Mann-Whitney. La valeur du P < 0.05 a été considérée comme statistiquement significative. L’analyse statistique a été menée en utilisant SPSS pour Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).
RESULTATS
1. Composition chimique :
L’analyse chimique des huiles essentielles étudiées a mis en évidence les constituants majeurs suivants :
- Pour Mentha pulegium : R(+)-pulégone (71.48%) et carvone (5,66%) (Tableau 4) ;
- Pour Cymbopogon citratus : Geraniol (27,13%), Citronellol (12,67%), Citronellal (32,77%) et citronellyl acetate (5,08%) (Tableau 5) ;
- Pour Citrus aurantium : β-pinene (8,73%), Linalool (33, 92%) et (E)-Nerolidol (5,24%) (Tableau 6) ;
- Pour Thymus vulgaris : Thymol (42.01%), P-Cymene (14.34%), γ-Terpinene (12.04%), Carvacrol (5.07%) (Tableau 7) ;
- Pour Origanum compactum : γ-terpinene (25.11%), Carvacrol (22.29%), Thymol (19.21 %), p-cymene (18.68 %) (Tableau 8) ;
Indice de Rétention (IR) Constituants % 939 -pinene 0.52 952 Cyclohexanone-3-methyl 0.26 980 -pinene 0.39 993 Myrcene 0.16 994 Octanol-3 1.86 1001 -2-carene 0.07 1031 Limonene 1.88 1072 p-mentha-3,8-diene 1.44 1154 Menthone 0.19 1168 Pinocarvone 1.27 1173 Menthol 0.72 1194 Dihydrocarvone 4.64 1238 R(+)-pulégone 71.48 1242 Carvone 5.66 1252 Peperitone 1.13 1418 -Caryophyllene 0.33 1630 -eudesmol 0.28 1649 -eudesmol 0.49 Total 92.77 Rendement 2.34
Indice de Rétention (IR) Constituants % 930 Tricyclene 0,04 936 -thujene 0,09 939 -pinene 2,22 975 -pinene 0,12 991 -myrcene 0,82 1023 Limonene 3,25 1098 Linalol 0,92 1146 Isopulegol 0,81 1165 Borneol 0,12 1171 Terpinen-4-ol 0,43 1192 -terpineol 0,54 1228 Citronellol 12,67 1255 Geraniol 27,13 1153 Citronellal 32,77 1240 Neral 0,44 1270 Geranial 0,38 1298 Carvacrol 0,13 1356 Eugenol 1,59 1354 citronellyl acetate 5,08 1383 Geranyl acetate 1,87 1391 -elemene 1,3 1480 Germacrene D 1,86 1513 -cadinene 0,32 1524 -cadinene 1,83 1549 Elemol 1,92 1649 -eudesmol 0,34 1653 -cadinol 0,08 Total 99.07 Rendement 1.8 %
Indice de Rétention (IR) Constituants % 936 -thujene 0.06 939 -pinene 0.82 953 Camphene 0.05 975 -pinene 8.72 991 -myrcene 1.88 1074 Linalool oxide 1.25 1088 α-Terpinolene 0.42 1098 Linalool 33.92 1165 Borneol 0.07 1177 Terpinen-4-ol 0.23 1192 -terpineol 3.54 1228 Nerol 0.37 1255 Geraniol 0.08 1240 Neral 0.05 1270 Geranial 0.06 1418 -Caryophyllene 1.21 1564 (E)-Nerolidol 5.24 1722 Farnesol 3.08 Total 61,05 Rendement 0.04
Indice de Rétention (IR) Constituants* Pourcentage (%)** 931 α-Thujene 2.10 939 α-Pinene 1.87 980 β-Pinene 0.79 988 Octan-l-en-3-ol 0.16 991 Myrcene 2.18 1005 α-Phellandrene 0.51 1018 α-Terpinene 2.04 1026 P-Cymene 14.34 1031 Limonene 1.01 1033 1,8-cineole 0.82 1062 γ-Terpinene 12.04 1068 Cis-sabinen hydrate 0.05 1087 Fenchone 0.06 1088 Terpinolene 0.78 1098 Linalool 4.41 1177 Terpinene-4-ol 1.08
1235 Thymol methyl ether 2.14
1290 Thymol 42.01 1298 Carvacrol 5.07 1352 Terpinyl acetate 0.41 1356 Eugenol 0.25 1391 β-elemene 0.15 1401 Methyl Eugenol 0.41 1418 β-Caryophyllene 0.82 1430 β-copaene 0.16 1454 α-Humlene 0.26 1480 Germacrene D 0.34 1509 -Bisabolene 0.37 1520 δ-cadinene 0.07 1581 Caryophyllene oxide 0.32 Total 97,02
*: constituants identifiés par GC-IK and GC-MS, **: Pourcentages des constituants donnés par GC Tableau 7 : Composition chimique deThymus vulgaris huile essentielle
Indice de Rétention (IR) Constituants % 931 α-thujene 0.22 939 α-pinene 0.54 948 Camphene 0.17 973 Sabinene 0.23 976 Sabinene 0.83 980 β-pinene 0.16 984 2-octanol 0.86 991 Myrcene 2.21 999 δ-2-carene 0.09 1005 α-Phellandrene 0.26 1011 δ-3-carene 0.08 1018 α-terpinene 2.79 1023 ο-cymene 0.48 1026 p-cymene 18.68 1143 Camphor 0.05 1050 β-E-ocimene 0.09 1062 γ-terpinene 25.11 1067 Cis-hydrate sabinene 0.15 1080 m-cymenene 0.14 1087 Terpinolene 0.07 1098 linalool 1.24 1165 borneol 0.20 1177 terpinen-4-ol 0.34 1184 ρ -cymen-8-ol 0.09 1189 α-terpineol 0.99 1290 Thymol 19.21 1298 Carvacrol 22.29 1418 E-caryophyllene 1.03 1513 γ−cadinene 0.05 1582 Caryophyllene oxide 0.06 Total 98.71
Indice de Rétention (IR) Constituants % 931 α-thujene 0.05 939 α-pinene 0.14 948 Camphene 0.07 973 Sabinene 0.09 980 β-pinene 0.06 991 -Myrcene 0.34 1011 δ-3-carene 0.08 1018 α-terpinene 0.09 1031 Limonene 0.28 1044 b-Ocimene 0.86 1098 Linalool 2.42 1228 Nerol 0.13 1240 Neral 0.21 1255 Geraniol 84.12 1270 Geranial 2.16 1383 Geranyl acetate 6.67 1418 b-Caryophyllene 0.54 1581 Caryophyllene oxide 0.64 Total 98.95
2. Activité antibactérienne :
Essai de diffusion en puits :
Après la période d’incubation (48h), des zones d'inhibition de croissance bactérienne sur gélose, concernant les 2 souches de Aa, sont observées et mesurées par un pied à coulisse (Fig 50-51) (Tableau 10). Cependant, aucun halo d’inhibition n’est obtenu pour les contrôles négatifs (Tween 80 pur et dilué à 10%) (Fig 52). Concernant, le témoin de croissance utilisé, une croissance bactérienne sous forme d’un film recouvrant la gélose est obtenue (Fig 53).
Fig 50 : Zone d’inhibition de croissance bactérienne produite par l’huile essentielle
(dans le puits) après 48h d’incubation
Fig 51 : Zone d’inhibition de croissance bactérienne produite par la Doxycycline (disque au centre de la gélose) après 48h
Les diamètres moyens des zones d’inhibition induits par la Doxycycline pour Aa isolat clinique et Aa référence (22,67 ± 1,15 et 19,33 ± 0,57 respectivement) sont significativement plus petits que ceux produits par les huiles essentielles testées à l’état pur (Mentha pulegium: 39 ± 1,00 et 34,67 ± 0,57, Citrus aurantium: 40 ± 0,00 et 34,33 ± 1,15 Cymbopogon citratus: 42,33 ± 2,51 et 41,33 ± 1,15, Thymus vulgaris 45,00 ± 6,24 et 47,33 ± 6,42, Origanum compactum 51,67 ± 5,77 et 53 ± 2,00, Cymbopogon martinii 39,00 ± 6,55 et 25,67 ± 1,15 respectivement) et à l’état dilué (1/10) (Mentha pulegium15,67 ± 0,57et 15,33 ± 0,57, Citrus aurantium: 15,33 ± 0,57 et 15,66 ± 0,57, Cymbopogon citratus: 28 ± 0,00 et 30,667 ± 1,15, Thymus vulgaris 18,67 ± 1,15 et 20 ± 3,00, Origanum compactum 17,67 ± 2,08 et 18,33 ± 0,57, Cymbopogon martinii 22,67 ± 1,52 et 20,50 ± 5,07 respectivement) (Tableau 10, Fig 54).
Pour toutes les valeurs de diamètres d’inhibition obtenues, aucune différence statistiquement significative n’a été enregistrée entre Aa isolat clinique (JP2) and Aa de référence (non-JP2) (P = 0.8).
Fig 52 : Absence de zone d’inhibition de croissance bactérienne pour les contrôles négatifs (Tween 80 pur et dilué à 10% dans
le puits) après 48h d’incubation
Fig 53 : Témoin de croissance bactérienne après 48h d’incubation (film bactérien
Diamètres des zones d’inhibition (mm) † (M±ET) Agents Aggregatibacter actinomycetemcomitansJP2 (isolat clinique) (N=24) Aggregatibacter actinomycetemcomitans non-JP2 (CIP 101032) (N=24) Mentha pulegium pur 39,00 ± 1,00 34,67 ± 0,57 1/10 15,67 ± 0,57 15,33 ± 0,57 Citrus aurantium pur 40,00 ± 0,00 34,33 ± 1,15 1/10 15,33 ± 0,57 15,66 ± 0,57 Cymbopogon citratus pur 42,33 ± 2,51 41,33 ± 1,15 1/10 28 ± 0,00 30,66 ± 1,15 Thymus vulgaris pur 45,00 ± 6,24 47,33 ± 6,42 1/10 18,67 ± 1,15 20 ± 3,00 Origanum compactum pur 51,67 ± 5,77** 53 ± 2,00*** 1/10 17,67 ± 2,08 18,33 ± 0,57 Cymbopogon martinii pur 39,00 ± 6,55 25,67 ± 1,15 1/10 22,67 ± 1,52 20,50 ± 5,07 Doxycycline (30µg) 22,67 ± 1,15 * 19,33 ± 0,57 * Tween 80 pur 6,00 ± 0††† 6,00 ± 0††† (10%) 6,00 ± 0° 6,00 ± 0° P <0,001 <0,001
N : nombre de l’effectif, M± ET : Moyenne ± Ecart Type (pour une expérimentation en triplicata), †:diamètre de la zone d’inhibition incluant le diamètre du puits (6mm). * : P <0,001: Doxycycline Vs Mentha pulegium, Citrus aurantium, Cymbopogon citratus, Thymus
vulgaris, Origanum compactum, Cymbopogon martinii (à l’état pur). ** : P < 0,05 : (P= 0,03) : Origanum compactum Vs Mentha pulegium et Cymbopogon martinii.
*** : P <0,001: Origanum compactum Vs Mentha pulegium, Citrus aurantium, Cymbopogon citratus