LES RAPPORTS EXTERNES

Visando confirmar a biodegradação anaeróbia da CF realizada na etapa anterior. Os efluentes dos digestores anaeróbios foram quantificados por cromatografia líquida de alta performance acoplada ao detector de ultravioleta (HPLC-UV). Para investigação de metabólitos formados da biodegradação da CF foram utilizados HPLC-PDA e o cromatógrafo gasoso (CG-MS).

As análises foram executadas no Laboratório Analítico Instrumental - Cromatografia do SENAI - CIC/SETSAM e no Instituto Ambiental do Paraná (IAP), ambos localizados em Curitiba.

Nesta etapa foram executados dois procedimentos e uma análise complementar:

1º procedimento: Detecção e quantificação da concentração de CF por HPLC-UV, nas amostras dos efluentes antes e após o tratamento.

Análise complementar: Análise por HPLC - Detector de PDA com varredura na faixa de 195 à 600nm, para a verificação de intermediários da CF.

2º procedimento: Determinação de metabólitos da degradação da CF após o tratamento anaeróbio por meio de cromatografia gasosa (CG-MS).

1º procedimento: Detecção e quantificação da concentração de CF por HPLC-UV, nas amostras antes

e após o tratamento. Este foi o principal procedimento, visto que foi empregado para determinar a eficiência do tratamento anaeróbio na biodegradação da CF.

Amostras: Efluentes dos reatores (amostra 1; 2; 3; 4; 5 e 6), antes e após o tratamento, oriunda da etapa-2 (Biodegradabilidade da Ciclofosfamida por Processo Anaeróbio), totalizando doze (12) amostras (06 antes e 06 após o tratamento).

Condições cromatográficas

O equipamento utilizado foi um HPLC (Hitachi Lachrom Elite) com auto sampler, bomba quaternária, forno para colunas e detector de UV;

Fase móvel: água / acetonitrila (60:40) com fluxo de 1,0 mL/min;
Temperatura do forno: 35ºC

Detector UV: 205 nm;
Injeção de 20 µL de amostra;

Tempo de retenção (TR) da ciclofosfamida: 2,09 min.
Tempo total de análise: 5 min e 45 min.

Validação da metodologia

A metodologia adotada foi baseada no estudo de HANSEL et al (1997). Visando melhorar o sistema de detecção, foi feito um enriquecimento das amostras e dos padrões utilizando o método de extração de fase sólida (SPE) com cartuchos de C18. Abaixo o procedimento executado:

Inicialmente foi realizada a ativação das colunas C18 (300 mg). As colunas foram ativadas com 5 mL de metanol grau HPLC e lavadas com 5 mL de água ultrapura. Através da coluna, utilizando uma bomba peristáltica, foram passados 50 mL do padrão e da amostra (uma coluna para cada), onde a CF ficou retida na coluna. Após a passagem do padrão e das amostras, as colunas foram secas a vácuo com fluxo de nitrogênio para a retirada de umidade por aproximadamente 1 h. Ao término deste intervalo, foi realizada a eluição da CF com 2,0 mL de metanol e o extrato obtido foi injetado no equipamento HPLC-UV.

Curva-padrão de ciclofosfamida

A solução padrão foi injetada no cromatógrafo líquido impreterivelmente no dia da injeção das amostras, com o objetivo de estabelecer uma curva-padrão do antineoplásico CF e possibilitar a detecção deste nas amostras de efluente antes e após-tratamento.

Porcentagem de remoção de Ciclofosfamida no efluente após-tratamento

Depois de detectada a concentração de CF, presente no efluente (antes e após-tratamento) foi calculada a porcentagem de remoção de CF no efluente pelo processo anaeróbio, utilizando a fórmula abaixo.

%

100

CF CF

redução

x

CF

−





= 







CFi: concentração de CF inicial (efluente antes-tratamento) CFf: concentração de CF final (efluente após-tratamento)

Análise complementar: Análise por HPLC - Detector de PDA com varredura na faixa de 195 à

600nm, para a verificação de intermediários da ciclofosfamida.

Amostra: Para realização desta análise, foi selecionada a amostra 5 (após o tratamento), que

corresponde ao reator n°5 (CF: 200,0 mg.L-1_{), cuja composição foi descrita na TAB. 7, do item 6.3.2.}

Condições cromatográficas

O equipamento utilizado foi um HPLC (Waters)com bomba quaternária, forno para colunas e detector de PDA (Diode Array Detector);

Fase Móvel: Água/Acetonitrila (60:40) com fluxo de 1,0 mL/min;
Temperatura do Forno: 35ºC;

Detector de PDA com varredura na faixa de 195 à 600nm;
Injeção de 20 µL de amostra;

Tempo de retenção da ciclofosfamida: 3,364 min.;
Tempo Total de análise: 40 min;

Coluna Gemini Phenomenex C18 (5µm) com 250mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro.

Validação da metodologia

A conduta adotada para validação da metodologia foi à mesma descrita para o 1º procedimento.

2º procedimento: Determinação de metabólitos da degradação da CF após o tratamento anaeróbio por

meio de cromatografia gasosa (CG-MS).

Amostra: Foi selecionada a amostra 5 (após o tratamento), que corresponde ao reator n°5 (CF:

200mg.L-1_{), cuja composição foi descrita na TAB. 7.}

Condições cromatográficas:

Cromatógrafo Gasoso (Varian modelo CP3900) com detector de espectrometria de massas (Varian modelo Saturn 2100T) e injetor automático (Varian CP-8410);

Fase Móvel: hélio com fluxo de 1,0 mL/min;
Injetor: 280ºC, modo de injeção split/splitless;

Temperatura do Forno: 110ºC por 1 min, aquecimento até 290ºC a 10ºC/min, permanecendo em 290ºC por 7 min;

Detector: Mass Range (EI) 120-400 u; Séc/Scan: 1; Multiplier Delay: 5,8min; RF Level: 79,4amu; Íon Trap Temp: 230ºC; Target: 25000;

Injeção de 2µL de extrato;

Tempo de retenção da ciclofosfamida: 14,05min. Tempo Total de análise: 26min;

Coluna: Coluna Capilar Factor Four Varian modelo VF-5MS (5% fenil, 95% dimetilpolisiloxano) (0,25µm de espessura de filme) com 30 m de comprimento e diâmetro interno de 0,25mm (Marca Varian).

Validação da metodologia

Para a análise por CG/MS, foi feita uma extração e uma derivatização da amostra e do padrão utilizando o método SPE com cartuchos C18, conforme descrito por TERNES (2001). Segue abaixo do procedimento adotado:

Inicialmente foi feita a ativação das colunas C18 (300mg). As colunas foram ativadas com 5mL de metanol grau HPLC e lavadas com 5mL de água ultrapura. Através da coluna, utilizando uma bomba peristáltica, passou-se 50 mL do padrão e da amostra (uma coluna para padrão e uma para cada amostra), a CF ficou retida na coluna. Após a passagem do padrão e da amostra, as colunas foram secas sob vácuo com fluxo de nitrogênio visando a retirada de umidade por aproximadamente 1h. Após este intervalo, foi realizada a eluição da CF com 2mL de metanol. O extrato obtido foi concentrado sob nitrogênio até aproximadamente 100µL, em seguida foi adicionado ao extrato 50µL de ácido trifluoracético (TFAA) para a derivatização. O extrato final foi analisado por CG/MS nas condições cromatográficas descritas acima.