A presença de micotoxinas em matrizes complexas, constituídas por lipídeos, proteínas e carboidratos, faz com que o grande desafio relacionado à análise dessas toxinas seja a escolha do método de extração adequado, principalmente no que diz respeito ao solvente extrator e pH do meio.
O solvente extrator deve ser capaz de solubilizar todas as micotoxinas estudadas sem promover reações paralelas que possam levar a degradação ou conversão das micotoxinas em outros produtos, e deve ser seletivo, extraindo preferencialmente os analitos em relação aos constituintes de matriz. Além disso, o pH do solvente extrator deve ser tal que favoreça a partição das micotoxinas preferencialmente no solvente orgânico, sem que ocorram reações ou degradação das micotoxinas durante ou após a extração.
O método QuEChERS é o mais amplamente conhecido e empregado para a extração de micotoxinas em diferentes matrizes.
Desenvolvido entre 2001 e 2002 por Michelangelo Anastassiades, o método QuEChERS (Rápido, Fácil, Barato, Efetivo, Robusto e Seguro, do inglês Quick, Easy,
Cheap, Effective, Rugged and Safe) foi inicialmente proposto para a análise de drogas
de uso veterinário em tecidos animais (LUCCI et al., 2012). Após constarem que o método era muito eficaz na extração de resíduos de pesticidas, Anastassiades e colaboradores publicaram, em 2003, o método detalhado para a extração de resíduos de pesticidas em frutas e vegetais (LUCCI et al.,2012; ANASTASSIADES et al., 2003). O método original consistia na extração dos resíduos de pesticidas de 10 g de amostra com 10 mL de acetonitrila, seguido de uma partição líquido-líquido formada pela adição de 4 g de sulfato de magnésio anidro (MgSO4) e 1 g de cloreto de sódio (NaCl). Os tubos eram submetidos à agitação e centrifugação, e 1 mL do extrato era submetido à uma etapa de purificação por extração em fase sólida dispersiva (d-SPE, do inglês Dispersive Solid Phase Extraction) com amina secundária primária (PSA, do inglês Primary Secondary Amine) para remoção de componentes polares da matriz e MgSO4 para remoção da água residual. Os tubos eram agitados e centrifugados novamente, e o extrato estava pronto para análise por cromatografia gasosa (GC, do inglês Gas Chromatography) (ANASTASSIADES et al., 2003).
O método QuEChERS foi otimizado para ampliar o escopo de pesticidas e matrizes e mais tarde, em 2007, uma nova proposta foi publicada por LEHOTAY et al. (2007), tornando-se o método oficial da Associação das Comunidades Analíticas (AOAC, do inglês Association of Analytical Communities). A otimização consistiu em um método no qual 15 g de amostra eram extraídas com 15 mL de acetonitrila contendo 1% de ácido acético, que depois de agitação, também passava por partição liquído-líquido com MgSO4. Nessa nova proposta, 6 g de MgSO4 eram adicionadas
com 1,5 g de acetato de sódio (CH3COONa). O tamponamento do pH do solvente de
extração com acetato de sódio foi o diferencial nessa otimização, pois permitiu melhorar a recuperação de pesticidas dependentes do pH. Essa nova versão também incluía uma etapa de purificação do extrato, e era a mesma condição proposta por ANASTASSIADES et al. (2003) (AOAC, 2007).
No ano seguinte, ANASTASSIADES et al. (2008) fizeram mais uma otimização no método QuEChERS cujo objetivo era proporcionar melhores condições para extração analitos mais difíceis em matrizes complexas. Nesta nova versão, 10 g de amostra eram extraídas com 10 mL de acetonitrila, com partição líquido-líquido a partir da adição de 4 g de MgSO4, 1 g de NaCl, 1 g de citrato de tri-sódio diidratado
(Na3C6H5O7.2 H2O) e 0,5 g de hidrogenocitrato de di-sódio sesquiidratado
(Na2HC6H5O7.1,5 H2O). Essa mistura de sais proporcionava pH tamponado na faixa
de 5,0 – 5,5, o que permitia a extração de uma grande variedade de pesticidas. Essa versão do método QuEChERS resultou no procedimento padrão europeu, denominado European Standard EN 15662 (2008).
Todas as variações do método QuEChERS são semelhantes no princípio da extração, partição e purificação. O solvente usado na extração é a acetonitrila, que apresenta polaridade intermediária quando comparado com solventes como metanol, acetona ou acetato de etila, o que faz desse um solvente adequado para extrair uma grande classe de compostos, com polaridades variadas (LUCCI et al., 2012; AGILENT TECHNOLOGIES, 2013).
A grande vantagem da acetonitrila é a facilidade na separação de fases na etapa da partição líquido-líquido, o que é dificultado quando se utiliza acetona ou metanol, por exemplo, devida a miscibilidade relativamente grande desses solventes com água. Também a extração com acetato de etila não é tão eficiente quando comparado à extração com acetonitrila, pois o acetato de etila também apresenta certa miscibilidade com água, além de extrair constituintes de matriz e dificultar a etapa de purificação por d-SPE (LUCCI et al., 2012; AGILENT TECHNOLOGIES, 2013).
A etapa de partição líquido-líquido é realizada pela adição de MgSO4, podendo
ou não ser adicionado simultaneamente NaCl. O MgSO4 tem propriedade secante,
logo, atrai para si as moléculas de água, induzindo a separação das fases. Além disso, a adição de NaCl também favorece a separação de fase e induz a partição dos analitos na fase orgânica, uma vez que a água tem maior facilidade para solvatar os íons pequenos do sal do que moléculas orgânicas relativamente grandes dos analitos. Além disso, a polaridade da fase orgânica pode ser modificada de acordo com as quantidades de MgSO4 e/ou NaCl adicionadas: adição de menores quantidades
desses sais favorece uma fase orgânica mais polar devido à maior proporção de água, o que pode favorecer a extração de compostos mais polares. Por outro lado, adicionar MgSO4 e/ou NaCl em maiores quantidades reduzirá o teor de água na fase orgânica,
diminuindo a polaridade desta fase e favorecendo a extração de analitos apolares ou de polaridade moderada (LUCCI et al., 2012; AGILENT TECHNOLOGIES, 2013).
A etapa de partição líquido-liquido pode conter, além dos sais necessários para induzir a separação de fases, sais que são capazes de tamponar o pH em uma faixa específica, que é o caso do acetato de sódio e dos citratos de sódio. O uso de um ou outro sal depende da faixa de pH que se deseja obter, que por sua vez será dependente da faixa de pH ótima para a extração de cada classe de compostos (pesticidas, fármacos, drogas de uso veterinário).
A etapa seguinte que consta nas versões do método QuEChERS é a purificação, feita pela adição de pequenas quantidades de sorbentes capazes de remover constituintes de matriz do extrato orgânico. Diferentes sorbentes podem ser utilizados de forma individual ou simultânea, dependendo dos constituintes de matriz que se quer remover. Por exemplo, PSA é utilizado para remover constituintes polares, como açúcares, ácidos graxos e proteínas. Já o C18 é utilizado para remover constituintes apolares, como lipídeos, e carbono grafitizado é utilizado para remover pigmentos, esteroides e constituintes apolares (LUCCI et al., 2012; AGILENT TECHNOLOGIES, 2013).
Embora tenha sido inicialmente desenvolvido para extração de drogas de uso veterinário em tecidos animais e resíduos de pesticidas em frutas e vegetais, o método QuEChERS vem sendo constantemente otimizado e aplicado por diversos autores para a extração de micotoxinas em diversas matrizes (EOM et al., 2017; JETTANAJIT; NHUJAK, 2016; KOESUKWIWAT; SANGUANKAEW; LEEPIPATPIBOON, 2014; VARGA et al., 2013)