Chapitre 3 : Utilisation d’un vecteur synthétique de petite taille comme outil
1.2 Le RAFT-c(RGD) 4
Des ligands présentant des motifs RGD multimériques ont été décrits. De par le
fonctionnement naturel des intégrines qui utilisent des interactions multivalentes, cette
approche permettrait une meilleure affinité des molécules mais aussi un système qui pourrait
améliorer le ciblage cellulaire. En effet, l’interaction multivalente des RGD induit une voie
d’endocytose dépendante des intégrines (Boturyn, Coll et al. 2004; Garanger, Boturyn et al.
2005; Temming, Schiffelers et al. 2005; Danhier, Le Breton et al. 2012).
Notre groupe a développé une plateforme peptidique RAFT (Regioselectivity Adressable
Functionalised Template), sur laquelle quatre séquences cRGD sont greffées, qui a montré
des propriétés de fixation spécifique à l’intégrine αvβ3 in vitro (Figure 10).
Figure 10 : Structure de la molécule RAFT-c(RGD)4
Le motif décapeptidique RAFT (surligné en rose) soutient 4 motifs c(RGD) (surlignés en vert)
Plusieurs avantages sont attribuables aux molécules transporteuses de RGD :
Les molécules thérapeutiques fixées dessus peuvent être internalisées avec une meilleure
affinité. La filtration glomérulaire rénale est diminuée grâce à l’augmentation de la taille de la
molécule transporteuse. Ceci permet une présence prolongée de la molécule dans la
circulation sanguine avec une augmentation du temps de demi-vie plasmatique et, ainsi, une
augmentation de la probabilité de fixation de la molécule sur son récepteur (Garanger,
Boturyn et al. 2005; Temming, Schiffelers et al. 2005).
Notre groupe a décrit la synthèse d’un motif décapeptidique cyclique (RAFT) mesurant
10 Angströms qui présente deux domaines fonctionnels avec un arrangement spatial contrôlé :
un domaine de plusieurs ligands pour la reconnaissance de l’intégrine et pour le ciblage
cellulaire et un domaine de marquage pour la détection et la caractérisation de cette liaison.
Les premières études ont montré que ces systèmes multivalents conservent les propriétés de
reconnaissance, de sélectivité et d’internalisation dans les cellules exprimant l’intégrine αvβ3
(Boturyn, Coll et al. 2004).
Par la suite, nous avons utilisé ce vecteur pour l’imagerie tumorale. Sur la face supérieure du
RAFT, quatre copies du motif peptidique c[RGDfK] ont été greffées pour reconnaître
l’intégrine αvβ3. La face inférieure peut être utilisée pour lier une ou deux molécules
thérapeutiques et/ou pour l’imagerie moléculaire.
Notre groupe a montré l’intérêt de la multivalence du RGD comme outil théranostique pour
améliorer le ciblage tumoral. En effet, lorsque nous administrons du Cy5-RAFT-c(-RGDfK-)
4par voie intraveineuse chez des souris porteuses de tumeurs exprimant l’intégrine αvβ3, le
ratio de la fluorescence tumeur/peau est de 15. Ceci peut s’expliquer par l’augmentation de la
durée de demi-vie plasmatique de la molécule entraînant son accumulation tumorale mais
également à l’amélioration de l’internalisation grâce à la multivalence des RGD et donc une
amélioration du ciblage tumoral (Garanger, Boturyn et al. 2005; Garanger, Boturyn et al.
2006; Jin, Josserand et al. 2007).
Nous avons montré par une technique de FRAP (Fluorescence Recovery After Bleaching) que
le RAFT-c(RGD)
4inhibe la mobilité latérale de l’intégrine αvβ3 dans la membrane
cytoplasmique, probablement à cause de la formation de clusters d’intégrines. Ceci met en
évidence que deux motifs cRGD fixés sur une même plateforme RAFT peuvent se lier à deux
intégrines. La microscopie électronique a établi la relation entre la présentation multimérique,
l’augmentation de l’affinité et la co-internalisation contrôlées par les intégrines. Des analyses
FCS ont mis en évidence que le RAFT-c(RGD)
4-Cy5 tétramérique a une affinité dix fois
supérieure pour son récepteur intégrine αvβ3 soluble par rapport à un motif cRGD-Cy5
monomérique. En effet, la constante d’affinité (Kd) du RAFT-RGD pour les intégrines
purifiées passe de 3,87nmol/L pour le RAFT-RGD à 41,70nmol/L pour le cyclo(-RGDfK). Le
RAFT-c(RAD)
4-Cy5, non spécifique, n’a pas interagi avec l’intégrine αvβ3 (Sancey,
Garanger et al. 2009).
Enfin, nous avons mis en évidence qu’une molécule de
99mTc-RAFT-c(RGD)
4permet une
imagerie moléculaire de l’intégrine αvβ3 in vivo dans un modèle de développement tumoral
chez la souris. La molécule a été principalement éliminée par les reins ce qui est généralement
le cas pour les molécules peptidiques (Briat, Wenk et al. 2012). Par ailleurs, il a été montré
que des injections intratumorales répétées de RAFT-(cRGD)
4chez la souris Nude réduisent la
croissance tumorale. De plus le RAFT-(cRGD)
4augmente significativement le ciblage
spécifique des tumeurs sous-cutanées de même que des métastases après une injection
intra-veineuse (Garanger, Boturyn et al. 2005; Jin, Josserand et al. 2006).
Enfin, le RAFT-c(RGD)
4ciblant les intégrines αvβ
3surexprimées au niveau des
néo-vaisseaux, son couplage avec un fluorophore permet d’imager l’angiogénèse après une
administration par voie systémique. Ainsi, notre groupe a mis en évidence que le
RAFT-c(RGD)
4-A700 permet d’évaluer les modifications angiogéniques in vivo avec une méthode
non-invasive, rapide, précise et reproductible (Keramidas, Josserand et al. 2013).
L’intérêt du RAFT-c(RGD)
4par rapport à d’autres molécules porteuses de RGD est que sa
synthèse chimique est facile et bien caractérisée, ce qui permet d’obtenir une molécule avec
une pharmacocinétique bonne et reproductible.
Ainsi, le RAFT-c(RGD)
4a été construit sur deux postulats. D’une part le RAFT est une
molécule rigide qui présente des motifs RGD de façon contrainte ce qui permet le clustering
par dimérisation des intégrines et une internalisation active de la molécule dans la cellule
cible. Grâce à sa structure, le RAFT est un espaceur naturel qui isole les motifs RGD en les
figeant dans une conformation spatiale optimale pour la réactivité des RGD et permet un
greffage multiple sans affecter dramatiquement les paramètres pharmacocinétiques ou la
réactivité. D’autre part, la multivalence RGD sur le RAFT améliore la force du RGD et son
affinité pour les intégrines purifiées ou les cellules, ce qui permet un meilleur ratio
tumeur/bruit.
Le RAFT-c(RGD)
4est un excellent outil théranostique car il présente une bonne
pharmacocinétique et une forte capacité de ciblage des tumeurs primaires ou métastasées
après administration systémique. Ainsi, le couplage du RAFT-c(RGD)
4avec un fluorophore
permet d’obtenir un outil puissant pour le diagnostic tumoral alors que son couplage avec un
peptide pro-apoptotique puissant fait de lui un outil de choix pour la thérapie anti-cancéreuse.
2 Protéines pro-apoptotiques Bax : utilisation de la voie
mitochondriale
L’apoptose dépend de la reconnaissance de signaux intra ou extracellulaires multiples, de
l’intégration de ces signaux et de l’activation d’une famille de protéases effectrices nommées
« caspases ». Il existe deux voies conduisant à l’apoptose. Une voie extrinsèque qui implique
un récepteur de mort cellulaire (Fas ou TNF Tumor Necrosis Factor) qui active les caspases
et une voie intrinsèque qui conduit à la libération du cytochrome c de la mitochondrie. Cette
voie est contrôlée par la famille des protéines Bcl-2 (Weissleder and Mahmood 2001).
Dans le document
Développement de vecteurs ciblants pour la détection et la thérapie des tumeurs
(Page 55-58)