10.2 R´esultats
10.2.1 R´egulation de l’activit´e endopeptidasique et de la transcription
sance cellulaire.
Pour montrer l’importance de la r´egulation du prot´easome pendant la croissance des arch´ees, l’activit´e peptidase du complexe 20S a ´et´e mesur´ee, ainsi que l’expression
des g`enes codants pour des sous-unit´es du syst`eme PAN-prot´easome.
Pour cela les prot´easomes natifs ont ´et´e partiellement purifi´es au cours de la croissance cellulaire de culture d’Halobacterium salinarum par ultracentrifugation en gradient de densit´e. Pour la visualisation de la r´egulation de l’activit´e transcriptionnelle, des exp´eriences de Northern-Blot sur les deux sous-unit´es du prot´easome ainsi que sur les deux PAN ont ´et´e r´ealis´ees (pour plus de pr´ecision sur les techniques et la m´ethode utilis´ees, se r´ef´erer `a l’article 16).
Les profils cin´etiques de l’activit´e endopeptidasique ont montr´e que l’accumulation du prot´easome 20S est modifi´ee en fonction de l’´etat physiologique des cellules (voir r´esultats figure 10.1 et figure 10.8 du chapitre 10.3.1).
Figure 10.1 – Modifications de l’activit´e du prot´easome 20S et de l’ex- pression des sous-unit´es du complexe PAN-prot´easome lors de la crois- sance cellulaire chez Halobacterium. A. Mesure de l’activit´es endopeptidasique du prot´easome 20S en utilisant le substrat peptidique fluorog´enique Suc-LLVY-AMC. L’activit´e peptidasique est trac´ee en fonction de la densit´e cellulaire (DO 600nm). B. Courbe de croissance d’Halobacterium : les chiffres en dessus des fl`eches correspondent aux diff´erents temps d’´echantillonnage utilis´es pour l’extraction des ARNs totaux. C. Analyse de l’expression des sous-unit´es du complexe PAN-prot´easome par Northern- Blot. Pour plus d’information sur les techniques exp´erimentales voir l’article en annexe
Un maximum d’activit´es endopeptidasiques ainsi qu’un maximum d’accumulation de transcrits des sous-unit´es du prot´easome ont ´et´e mesur´es dans les extraits cellulaires en d´ebut de phase exponentielle (autour d’une DO de 0,6). Puis, pendant la phase de croissance exponentielle, une r´eduction drastique est observable pour `a la fois l’activit´e endopeptidasique (divis´ee par 3 par rapport `a l’activit´e maximum mesur´ee `a la DO 0,6) et l’accumulation des ARNm. Un l´eger regain arrive en phase stationnaire (apr`es la DO 1,2). Une r´egulation transcriptionnelle semblable a ´egalement ´et´e observ´ee pour les deux sous-unit´es activatrices PAN.
Un changement de l’activit´e du prot´easome avait d´ej`a ´et´e observ´ee au cours de la croissance chez la levure o`u l’assemblage du prot´easome 20S est n´ecessaire pour la sur- vie durant la phase stationnaire [115]. Chez les arch´ees, une accumulation du niveau des transcripts du prot´easome avait aussi ´et´e d´etect´ee chez Haloferax volcanii au cours de la phase stationnaire [116]. Prises ensembles, ces observations sugg`erent que la r´egulation transcriptionnelle intervient sur tous les composants du syst`eme Pan-prot´easome et que cette r´egulation est importante pour le contrˆole de l’activit´e prot´eolytique intracel- lulaire en fonction de la phase de croissance. L’augmentation observ´ee dans l’activit´e prot´eolytiques combin´ee avec l’accumulation cellulaire du complexe prot´eolytique PAN- prot´easome pourrait ˆetre n´ecessaire pour ´eliminer les produits d´efectueux r´esultants de la traduction ribosomale en d´ebut de croissance c’est-`a-dire lorsque les cellules sont en train de traduire activement de nouvelles prot´eines, mais aussi pour l’´elimination de prot´eines ind´esirables `a des fins m´etaboliques ou de r´egulations au cours de la phase stationnaire.
10.2.2
R´egulation de l’activit´e endopeptidasique et de la trans-
cription du syst`eme PAN-prot´easome au cours de la
r´eponse aux stress.
Chez les micro-organismes, les stress de nature physique provoquent des chan- gements de conformation des prot´eines intracellulaires. S’il est bien connu que les prot´eines chaperonnes sont induites dans ces conditions chez les arch´ees, la r´egulation du syst`eme prot´easome n’est pas encore totalement d´efini.
De pr´ec´edentes ´etudes de transcriptomie ont montr´e, chez les arch´ees hyperthermo- philes, que la quantit´e d’ARNm d’une des deux sous-unit´es b´eta du prot´easome ´etait augment´ee lors de stress thermiques, tandis que la quantit´e d’ARNm de la sous-unit´e alpha est en baisse [117].
Pour ´etudier la r´eponse aux stress, nous avons choisi dans ce travail, le stress ther- mique, mais aussi des conditions de stress hypo-salin pour lesquelles les prot´eines mal- repli´ees s’accumulent (voir r´esultats figures 10.2 pour le stress thermique et 10.3 pour le stress hypo-salin).
Figure 10.2 – Mesure de l’activit´e du prot´easome 20S et quantification de l’accumulation de transcript des quatre g`enes codant pour les sous-unit´es du syst`eme PAN-prot´easome lors d’une r´eponse `a un stress thermique chez Halobacterium.A. Activit´es endo-peptidases intracellulaires du complexe 20S. Une culture est divis´ee en deux, une partie est mise `a 37˚C (triangles blancs) l’autre `a 55˚C (triangles noirs). B. Analyse du nombre d’ARNm par Northern-blot des diff´erentes sous-unit´es du complexe PAN-prot´easome lors de l’application sur les cultures d’un stress thermique `a 55˚C, mesures effectu´ees dans les premiers temps de la r´eponse au stress.
Figure 10.3 – Induction de l’activit´e du prot´easome 20S et quantification de l’accumulation de transcript des quatre g`enes codant pour les sous-unit´es du syst`eme PAN-prot´easome lors d’une r´eponse `a un stress hypo-salin chez Halobacterium.A. Activit´es endo-peptidases intracellulaires du complexe 20S. Une culture est divis´ee en deux, une partie est dilu´ee avec du milieu normal (triangles blancs) l’autre avec un milieu sans sel (triangles noirs) les volumes `a ajouter sont ajust´e afin d’avoir une concentration extracellulaire en NaCl de 4,2M et 2,5M respectivement. B. Analyse du nombre d’ARNm par Northern-blot des diff´erentes sous-unit´e du complexe PAN-prot´easome lors de l’application sur les cultures d’un stress hypo-salin `a 2,5M NaCl extracellulaire, mesures effectu´ees dans les premiers temps de la r´eponse au stress.
Apr`es l’exposition au stress, que se soit pour le stress thermique ou hypo-salin, nous avons mesur´e une augmentation significative de l’activit´e du prot´easome ainsi qu’une forte accumulation de transcripts des sous-unit´es alpha et bˆeta du prot´easome, ainsi que des deux sous-unit´es du complexe PAN.
Chez T.acidophilum, il a ´et´e montr´e qu’une inhibition chimique partielle de l’acti- vit´e peptidasique 20S r´eduit consid´erablement la capacit´e des cellules `a surmonter le choc thermique [118]. En outre, les complexes du prot´easome 20S de T.acidophilum et de H.marismortui restent stables, in vitro, dans des conditions de stress thermique et de stress hypo-salin et conservent dans ces conditions une activit´e endo-peptidasique permettant la destruction des prot´eines mal repli´ees [119] [120].
Nos observations sugg`erent que, chez les arch´ees halophiles, la r´egulation transcription- nelle coordonn´ee de toutes les sous-unit´es du complexe PAN-prot´easome joue un rˆole important dans la r´eponse cellulaire aux stress environnementaux et donc dans l’adap- tation extrˆemophile pour compenser l’effet d´el´et`ere des variations de temp´erature et de sel sur la stabilit´e des prot´eines.