Effet des drogues sur l’activit´e du prot´easome

Les cultures trait´ees ou non avec les 4 drogues ont ´et´e culott´ees, lys´ees et le prot´eome a ´et´e fractionn´e sur gradient de sucrose 5-20%. Ensuite, tout comme dans l’´etude sur le prot´easome avec l’inhibiteur NLVS, des tests d’activit´e endopeptidasique utilisant le substrat Succ-L-L-V-Y-AMC (voir Mat´eriels et M´ethodes) on ´et´e r´ealis´es sur chaque fraction (voir r´esultat figure 10.7).

Figure <sub>10.7 – Mesure de l’activit´e endo-peptidasique apr`es inhibition ou non du</sub> prot´easome Halobacterium in vivo par les diff´erentes drogues. Mesure de l’activit´e endo-peptidase utilisant le substrat Succ-L-L-V-Y-AMC en fonction de chaque fraction obtenue `a partir d’un gradient de sucrose r´ealis´e sur le S30 de cellules Halobacterium trait´ees ou non (exp´erience contrˆole) pendant 72h avec les quatre diff´erents inhibiteurs du prot´easome aux concentrations indiqu´ees entre parenth`eses.

L’exp´erience contrˆole correspondant aux fractions cytosoliques de cellules n’ayant pas ´et´e cultiv´ees en pr´esence d’inhibiteur du prot´easome, montre un profil caract´eristique, constitu´e de deux pics d’activit´e endopeptidasique. L’un est situ´e dans les fractions 3-4- 5 (appel´ees fractions de bas poids mol´eculaire BPM ) et l’autre dans les fractions 8-9-10 (appel´ees fractions haut poids mol´eculaire HPM ). L’activit´e sur les fractions de bas poids mol´eculaire correspond `a l’activit´e de prot´eases intracellulaires inconnues, tandis que l’activit´e de fractions de haut poids mol´eculaire correspond `a celle du prot´easome 20S (voir la correspondance entre les fractions du gradient de sucrose et la position du prot´easome dans le gradient dans l’article 16. Ces pools de fractions sont int´eressants car les fractions HPM correspondent `a un pool o`u l’on retrouve l’activit´e endopepti- dasique du prot´easome et les fractions BPM correspondent `a un pool o`u l’on retrouve

des activit´e endo-peptidasiques pouvant compenser un blocage du prot´easome et dont l’activit´e n’est pas sensible au NLVS.

Il est possible de remarquer que les profils observ´es sur la figure pr´ec´edente ne cor- respondent pas exactement `a celui de la figure 10.5, cela s’explique par le fait que les profils d’activit´es endopeptidasiques des fractions BPM et HPM d´ependent de l’´etat de croissance des cellule(voir figure 10.8, `a partir de ces r´esultats il est possible de voir que d’une part l’activit´e du prot´easome fluctue au cours de la croissance (r´esultats similaires `a la figure 10.1 A) et que d’autre part l’activit´e endopeptidasique des autres prot´eases cytosoliques fluctue presque de fa¸con identique pendant la croissance. En ef- fet une forte activit´e endo-peptidasique est d´etect´ee en d´ebut de croissance (donc apr`es dilution d’une culture m`ere), puis l’activit´e chute `a son minimum pour des cultures en d´ebut de phase exponentielle (activit´e divis´e par 5), ensuite l’activit´e augmente pro- gressivement pour atteindre son maximum en d´ebut de phase stationnaire.

Figure _{10.8 – Mesure de l’activit´e endopeptidasique sur les fractions de bas} poids mol´eculaire et de haut poids mol´eculaire au cours de la croissance cel- lulaire. En rouge et en bleu, respectivement l’activit´e endopeptidasique des fractions de haut poids mol´eculaires (HPM) et de bas poids mol´eculaire (BPM) obtenues par fractionnement sur gradient de sucrose d’une culture au cours de la croissance.

Lors de la mesure de l’activit´e du prot´easome dans les extraits de cellules trait´ees par les diff´erents inhibiteurs (fractions HPM de la figure 10.7) , il a ´et´e possible de remarquer diff´erents effets des drogues sur le profil d’activit´e endopeptidasique. Ainsi le traite- ment avec le PI1 semble inefficace, tandis que les autres inhibiteurs du prot´easome pro- voquent une diminution de cette activit´e. Ainsi, le traitement avec la clasto-lactacystin β-lactone (cLβL) entraine une chute d’environ 50% de l’activit´e du prot´easome, tan- dis que celle provoqu´ee par le MG-132 est presque totale. Enfin, l’inhibition compl`ete du prot´easome est observ´ee lorsque les cellules sont trait´ees avec l’epoxomycine qui constitue donc l’inhibiteur le plus efficace. Nous pouvons donc conclure que, mˆeme avec un prot´easome fortement inhib´e par ces drogues, les Archaea restent vivantes et parviennent `a se diviser. Par contre en regardant l’activit´e des fractions de BPM nous pouvons observer que la sp´ecificit´e de ces drogues vis-`a-vis du prot´easome n’est pas optimal pour les drogues MG132 et Epoxomycine, car en effet ces drogues abaissent ´egalement l’activit´e d´etect´ee dans les fractions BPM. Par contre, le traitement des cel- lules par la cLβL provoque, parall`element `a la baisse d’activit´e du prot´easome, une augmentation de l’activit´e endopeptidasique dans les fractions BPM, cette observation avait aussi ´et´e faite pour la drogue NLVS (donn´ees non montr´ee dans l’article).

Afin de v´erifier l’action et la sp´ecificit´e in vitro de ces inhibiteurs sur le prot´easome 20S, les fractions d’int´erˆets (de BPM : fractions 3-4-5 et HPM : fractions 8-9-10) d’une culture en conditions normales ont ´et´e trait´ees pendant 1 heure avec les diff´erentes drogues inhibitrices. Puis l’activit´e endopeptidasique a ´et´e mesur´ee (10.9A et B). Pour visualiser un effet optimal des inhibiteurs au bout d’une heure, nous avons choisi d’uti- liser des concentrations sup´erieures `a celle de l’exp´erience in vivo.

Figure <sub>10.9 – Mesure de l’activit´e endo-peptidasique apr`es inhibition ou</sub> non du prot´easome in vitro par les diff´erentes drogues. Mesure de l’action des drogues in vitro sur l’activit´e endopeptidasique en utilisant le substrat Succ-L- L-V-Y-AMC. Les prot´eines d’une culture en conditions normales ont ´et´e fractionn´ees sur un gradient de sucrose 5-20%, les fractions num´eros 8-9-10 et 3-4-5 sont r´ecup´ees ensembles pour former un pool d’´echantillon de haut poids mol´eculaire (HPM) et de bas poids mol´eculaire (BPM). On mesure sur chaque pool de fractions l’effet de l’ajout des drogues lors du test de l’activit´e endo-peptidasique (les ´echantillons sont incub´es 1h avec les droques). Les histogrammes correspondent aux pourcentages d’activit´e endo- peptidasique par rapport `a l’exp´erience sans inhibiteur (contrˆole).A. correspond aux

Dans les fractions de HPM (r´esultats figure 10.9 B ), nous pouvons voir une diminu- tion de l’activit´e endopeptidasique du prot´easome pour tous les inhibiteurs test´es. Ces drogues affecte donc bien le prot´easome in vitro d’une fa¸con beaucoup plus importante que dans l’exp´erience in vivo : 90% de l’activit´e est inhib´ee au minimum. L’augmen- tation de l’inhibition du prot´easome in vitro par rapport au in vivo peut s’expliquer par :

– Les concentrations des drogues inhibitrices utilis´ees.

– Le fait que les inhibiteurs peuvent agir directement sur le prot´easome, sans devoir passer la membrane cellulaire.

– Un temps d’incubation ”rapide”, qui va limiter la d´egradation des inhibiteurs. On peut remarquer que l’´epoxomycine est l’inhibiteur le plus efficace `a la concentration de 50µM.

Dans les fractions BPM (r´esultats figure 10.9 ) il est possible d’observer la sp´ecificit´e de ces inhibiteurs. A l’exception de l’´epoxomycine qui inhibe tr`es fortement l’activit´e endopeptidasique des fractions BPM, les inhibiteurs ne diminuent que l´eg`erement (au- tour de 20%) l’activit´e endopeptidasique totale des autres prot´eases cytosoliques et cela mˆeme `a forte concentration.

En conclusion, le meilleur candidat pour remplacer la drogue inhibitrice du prot´easome NLVS semble ˆetre la CLβL : elle permet d’inhiber tr`es fortement le prot´easome in vi- tro, elle inhibe tr`es l´eg`erement l’activit´e endopeptidasique pr´esente dans les fractions BPM, elle est capable de p´en´etrer les cellules d’arch´ees et ainsi atteindre le prot´easome in vivo, elle permet d’observer une activit´e compensatoire in vivo dans les fractions BPM. Il faut cependant optimiser sa concentration `a utiliser in vivo pour avoir un effet d’inhibition du prot´easome comparable `a celui de la drogue inhibitrice NLVS.