Matériel et Méthodes
R EACTIFS POUR LES EXPERIENCES IN - VITRO
Anticorps
L’anticorps monoclonal de souris dirigé contre ADAM10 humain est le 11g2, et a été décrit dans (Arduise et al., 2008). Les anticorps monoclonaux de souris Notch et anti-ADAM17 humains sont de chez R&D Systems et l’anti-PDI de chez Abcam. Les anticorps anti-GFP utilisés sont le biclonal de chez Roche (pour les IP) et un polyclonal de lapin de chez Santa Cruz Biotechnologies (pour le western-blot), l’anti-HA est le HA11 de chez Covance, l’anti-V5 est un monoclonal de souris (pour les IP) ou un polyclonal de chez Sigma-Aldrich (pour les western-blots). Les anticorps anti-tétraspanines utilisés sont le TS9 (CD9), TS81 (CD81), TS151 (CD151), TS63 (CD63), 1F11 (CD9P-1) ont été produits au laboratoire.
Oligos utilisés pour les expériences de déplétion par ARN interférence Contrôle : Stealth RNAi Negative Control Medium GC
Tspan5 : AUGUCAUCCCGAUAUGCUCUGAUGU
Tspan14 : CGCCAUCUCGCUGUUGCAGAUAUUU Tspan15 : ACAACCUGUACCUUCUCCAAGCAUU
CD81 : GCACCAAGUGCAUCAAGUA-dTdT
Lignées cellulaires utilisées
Les cellules HeLa (carcinome cervical), HCT116 (carcinome colique), PC3 (carcinome de la prostate), HEK293 (cellules de rein embryonnaire humain) sont cultivées en DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF). Les cellules sont transfectées avec le Fugene6 (Promega) ou la lipofectamine 2000 (Invitrogen) selon les indications du fournisseur. Les cellules OP9 exprimant le ligand de Notch DLL-1 (OP9-DLL1) et les cellules U2OS exprimant Notch1 (U2OS-N1) ont été obtenues par infection avec des rétrovirus comportant l’ADN complémentaire (ADNc) de DLL-1 cloné dans le vecteur MSCV-IRES-GFP ou l’ADNc de Notch1 humain cloné dans le vecteur pBabe puro. Ces deux lignées cellulaires ont été décrits précédemment (Moretti et al., 2010; Six et al., 2004). Les cellules S2 (cellules de
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Plasmides utilisés
Toutes les tétraspanines étiquetées V5 ou GFP sont d’origine humaine. Les régions codantes ont été amplifiées par PCR à partir de plasmides précédemment décrits (Tspan1, Tspan5, Tspan9, Tspan12 et Tspan15 (Serru et al., 2000)), de plasmides obtenus auprès d’Open Biosystems (Tspan10 et Tspan33) ou d’une transcription inverse à partir des cellules HCT116 (Tspan14). Les produits PCR ont ensuite été sous-clonés dans les vecteurs Directional TOPO pEGFP-N1, pEGFP-N3 ou pcDNA3. Tspan17 et Tspan5 ont été synthétisés par Eurogentec. Les constructions murines étiquetées Myc de Notch1 ΔE et NICD (dans le vecteur pCS2+MT) et l’ADAM10 bovin étiqueté HA (dans le vecteur pcDNA3) ont été décrits précédemment (Lammich et al., 1999; Jarriault et al., 1995).
Analyse par cytométrie de flux
Les cellules sont détachées, lavées deux fois en milieu DMEM supplémenté avec 10% de SVF puis incubées pendant 30 minutes à 4°C avec 10μg/ml d’anticorps primaire (la plupart du temps des anticorps produits chez la souris). Après trois lavages, les cellules sont incubées pendant 30 minutes à 4°C avec un anticorps de chèvre anti-souris conjugué à un fluorochrome (FITC ou PE pour les marquages de cellules non transfectées ; APC pour les marquages de cellules transfectées avec des constructions GFP). Les cellules sont analysées avec un FACScalibur avec les paramètres de compensation appropriés ou un Accuri C6. Les cellules sont détachées avec l’accutase sauf pour les marquages Notch1 pour lesquels les cellules sont détachées avec une solution de citrate de sodium 15mM et chlorure de potassium 0,135mM.
Immunoprécipitation, pontage chimique et marquage des protéines de surface à la biotine
Les cellules sont lavées trois fois en PBS 1X puis incubées avec une solution de biotine à 0,5mg/ml pendant 45 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite lavées trois fois en PBS puis lysées dans du tampon de lyse contenant 30mM de Tris pH 7.4, 150mM NaCl, des inhibiteurs de protéase et 1% de détergent (Brij97 ou digitonine). Après 30 minutes d’incubation à 4°C, le matériel insoluble est retiré par une centrifugation à 10.000g pendant 15 minutes. Le lysat cellulaire est ensuite incubé avec du sérum de chèvre inactivé et des billes de protéine G-sepharose (GE Healthcare) pendant 2 heures. Les billes sont retirées par centrifugation et le
lysat cellulaire est incubé avec 1μg d’anticorps primaire et 10μl de billes de protéine G-sépharose pour 200-400μl de lysat pendant 2h à 4°C sur une roue tournante. Les billes sont lavées quatre fois en utilisant le tampon de lyse avec 1% du détergent qui a servi à la lyse puis mises en tampon Laemmli. Les protéines immunoprécipitées sont ensuite séparées par SDS-PAGE en conditions non réductrices et transférées sur membrane PVDF (polyvinyl difluoride, GE Healthcare). Les immunoprécipitats sont analysés par western-blot en utilisant des anticorps primaires directement couplés Alexa Fluor 680 ou une combinaison d’anticorps primaires révélés par des anticorps secondaire couplés Alexa Fluor 680 ou IRDye 800. Les révélations du marquage biotine sont réalisés avec la streptavidine couplée Alexa Fluor 680 ou IRDye800. Les acquisitions sont effectuées avec l’Odyssey Infrared Imaging System® (LI-COR Biosciences).
Pour les expériences de pontage chimique, des cellules HEK293 ont été transfectées transitoirement avec un plasmide codant pour ADAM10-HA et différentes tétraspanines étiquetées GFP. 48h après la transfection, les cellules sont traitées avec 1mM de dithiobis[succinimidyl propionate] (DSP) pendant 30 minutes à 4°C puis lysées en tampon de lyse supplémenté avec 1% de Triton X100 et à.2% de SDS. Les lysats sont ensuite débarrassés du matériel insoluble et immunoprécipités selon le protocole ci-dessus.
RT-PCR quantitative
L’ARN est extrait à partir de 5x106
cellules de différentes lignées cellulaires en utilisant le kit SV Total RNA Isolation System avec une digestion de l’ADN sur colonne (Promega), en suivant les instructions du fournisseur. L’ADNc est synthétisé à partir de 5μg d’ARN total pour chaque échantillon en utilisant 200U de transcriptase inverse SuperScriptIII (Invitrogen) amorcée avec des hexamères aléatoires (Promega). Les réactions de polymérisation en chaine quantitative en temps réel (qPCR) sont réalisées dans un volume total de 25μl contenant 2x de Brillant II SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent), 0.4μM des primers sens et anti-senset 62.5μg d’ADNc. Les quantifications sont faites à l’aide du Mx3005P qPCR Systems et analysées par le logiciel MxPro d’Agilent Technologies. Pour chaque échantillon d’ADNc, les analyses sont faites en triplicats et les données sont normalisées à l’expression de rpl38 en utilisant la méthode du ΔCt. La plupart des oligonucléotides ont été créés avec PrimerBank (Spandidos et al., 2010) :
Tspan5: ACAAGGGTCCTGAAGTCAGTT et TGATGGAAGAGATGTTGGACAGA
Tspan10: CTGCGTCAAGTATCTGATCTTCC et AAGCCACGTAACAGGCAGG
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Tspan15: ACTTCCTGAACGACAACATTCG et CGCCACAGCACTTGAACTTTT
Tspan17: CTGCTGCGGGAAATACTTCCT et GATGTTCGAGAGAACGCCCTT
Tspan33: CTACGCTCGGCTAATGAAGCA et TGAGCAGGAACATGAGGACAC
ADAM10: AAACACCAGCGTGCCAAAAG et CCCTCTTCATTCGTAGGTTGAAA.
Immunomarquages et microscopie
Les cellules humaines sont cultivées pendant 24h sur lamelles de verre en DMEM supplémenté de 10% de SVF. Pour les comparaisons des niveaux totaux et de surface d’ADAM10, les cellules ont été fixées en paraformaldéhyde (PFA) 4% pendant 30 minutes à température ambiante, incubées pendant 15 minutes avec une solution de chlorure d’ammonium 50mM pour bloquer les sites réactifs du PFA n’ayant pas réagis et perméabilisées, ou non, avec 0.1% de Triton X100 pendant 2 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite incubées avec 10μg/ml de chaque anticorps primaire (jusqu’à deux anticorps primaires ont été utilisés conjointement) pendant 1h à température ambiante. Les cellules sont ensuite lavées en DMEM supplémenté de 10% de SVF et les anticorps primaires sont révélés par des anticorps secondaires couplés Alexa Fluor 488 et/ou 568 pendant 1h à température ambiante. Les cellules sont ensuite lavées en DMEM supplémenté de 10% de SVF et les cellules sont montées en Mowiol 4-88 (81381 ; Aldrich) supplémenté en DABCO (D2522 ; Sigma-Aldrich) et en DAPI. Les acquisitions sont faites à l’aide d’un microscope à fluorescence DMR (Leica) équipé d’une caméra CoolSnap HQ2 (Photometrics) et controlé par le logiciel MetaMorph (Molecular Devices). Les acquisitions ont aussi été faites à l’aide du microscope confocal Leica SP5 équipé d’un objectif à immersion 63x. Les images ont été traitées avec le logiciel ImageJ (National Institute of Health).
Analyse de la glycosylation d’ADAM10
Les cellules sont lavées trois fois en PBS puis lysées en tampon de lyse avec 1% Brij97 pendant 30 minutes à 4°C. Le matériel insoluble est retiré par centrifugation à 10.000g pendant 15 minutes et le lysat est incubé avec 1μg de 11G2 et 10μl de billes de protéines G-sépharose pendant 2 heures à 4°C sur une roue tournante. Les billes sont lavées quatre fois en utilisant le tampon qui a servi à la lyse. Les protéines immunoprécipitées sont détachées des billes en les faisant bouillir dans une solution de Triton X100 1% et SDS 0.2%. Un tampon au phosphate de sodium 20mM pH 7,2 est ajouté avec la PNGase et l’Endo-H et l’incubation est laissée sur la nuit. Le lendemain, les protéines sont resuspendues en tampon Laemmli, séparées par SDS-PAGE et analysée par western-blot.
Analyse de l’activité de Notch dans les cellules de mammifères
Ces analyses ont été réalisées comme décrit précédemment (Moretti et al., 2010). Des cellules U2OS-N1 et HeLa sont ensemencées à 25.000 cellules/cm2. La déplétion par ARN interférence est réalisée par le protocole de transfection inverse Interferin (PolyPlus Transfection). 3nM d’ARNi est déposé dans le puits avant de recouvrir avec les cellules. Les cellules sont ensuite transfectées 24h après avec le rapporteur CSL firefly et le plasmide contrôle Renilla en utilisant le FuGene6 (Promega). 24h après, 35.000 cellules/cm2 d’OP9+/-DLL1 sont ajoutées et les activités firefly et Renilla luciférase sont déterminées en utilisant le Dual luciferase reporter assay (Promega) selon les données du fournisseur. L’analyse statistique est effectuée en utilisant le test one-way ANOVA suivi d’un test de comparaison multiple de Tukey.
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