Matériel et Méthodes
R OLES DES REGIONS CONSERVEES DANS LA GRANDE BOUCLE EXTRACELLULAIRE DES TSPANC8 POUR L’INTERACTION AVEC ADAM10
L’alignement des tétraspaniens de la sous-famille des TspanC8 a permis d’identifier des zones de fortes conservations. Ces zones ont une probabilité plus forte de contenir les résidus qui sont importants pour l’interaction avec ADAM10, qui est une fonction partagée par tous les membres de la sous-famille. Ainsi nous avons identifié un motif rDDxDlqn (une minuscule indique que le résidu est conservé dans au moins 4 TspanC8 et une majuscule indique qu’il est conservé dans toutes les TspanC8), situé entre les hélices A et B de la grande boucle extracellulaire, présent dans les TspanC8 mais pas dans CD151 (figure 41A). Cette zone est très peu conservée parmi les différentes tétraspanines mais présente de fortes homologies parmi les membres de la sous-famille TspanC8. En prenant Tspan5 comme modèle nous avons étudié par western-blot après IP l’impact de la mutation des ces résidus sur sa capacité d’interagir avec ADAM10. Des cellules HeLa ont été transfectées transitoirement avec les différents mutants de Tspan5 puis lysées en digitonine pour révéler les complexes primaires. Nous avons ainsi démontré que la mutation des résidus RDD entraine une perte de l’interaction avec ADAM10, que les résidus DID ne semblent pas essentiels et que la mutation des résidus DLQ, malgré une moins bonne transfection de la tétraspanine mutée et une différence de migration par rapport à la forme sauvage, n’abolit pas l’interaction avec ADAM10 (figure 41B). Un deuxième motif conservé dans les TspanC8 est le motif NxYFN, situé après l’hélice B. La mutation de ce motif dans Tspan5 aboutit à une perte totale de l’interaction avec ADAM10 (figure 41B). Enfin, la capacité des mutants à augmenter le niveau d’expression de surface d’ADAM10 a été analysée par cytométrie de flux bi-paramétrique. Seuls les mutants dont l’interaction a été démontrée biochimiquement sont capables d’augmenter le niveau de surface d’ADAM10 (figure 42A).
L’ensemble de ces données montre que la présence des résidus RD et LQ au sein du motif RDDIDLQ et le motif NIYF sont nécessaires pour avoir une interaction optimale de Tspan5 avec ADAM10 et un adressage à la membrane plasmique.
116 Figure 41 : La mutation de zones conservées dans les TspanC8 entraine la perte de
l’interaction avec ADAM10
(A) Alignement d’une partie de la grande boucle extracellulaire des tétraspanines montrant la conservation de motifs RDDxDLQN et NxYFN chez les TspanC8, absents dans la séquence du CD151 (une tétraspanine n’appartenant pas à la sous-famille). Les acides aminés en violet sont des acides aminés commun à toutes les tétraspanines, en rouge ceux spécifiques des TspanC8 et en vert ceux spécifiques et présents dans au moins 60% des TspanC8.
(B) Analyse par western-blot après IP de cellules HeLa transfectées transitoirement avec les différents mutants de Tspan5 et lysées en digitonine. Les séquences après mutation du motif RDDIDLQ sont présentées. Le mutant NIYF correspond au remplacement de ces acides aminés par des alanines.
Figure 42 : La mutation de certains résidus de la grande boucle extracellulaire de
Tspan5 ne permet plus l’adressage d’ADAM10 à la surface cellulaire
(A) Analyse par cytométrie de flux du niveau d’expression de surface d’ADAM10 de cellules HeLa transfectées transitoirement avec les différents mutants de Tspan5. (B) Quantification de l’augmentation de l’expression de surface d’ADAM10. Les
données représentent le facteur d’augmentation de l’expression de surface dans les cellules transfectées (GFP positives) par rapport aux cellules non transfectées (GFP négatives) du même échantillon.
118 Néanmoins, les données sur les mutants de Tspan5 sont à nuancer. En effet, nous avons étudié leur localisation sub-cellulaire dans des cellules HeLa transfectées transitoirement (figure 43). Le mutant DID, qui interagit normalement avec ADAM10, est presque exclusivement exprimé à la surface cellulaire. La localisation du mutant DLQ est plus proche de celle observée pour le Tspan5 non muté, avec une localisation principalement membranaire et une composante intracellulaire. Les mutants NIYF et RDD, qui sont les deux seuls mutants avec lesquels une perte de l’interaction avec ADAM10 est observée, présentent une localisation qui est exclusivement intracellulaire et qui est typique d’un marquage réticulum endoplasmique. A partir de ces données, un défaut dans la conformation de la protéine mutante ne peut être exclu et des données supplémentaires sont nécessaires pour conclure de façon définitive pour les deux mutants RDD et NIYF.
Figure 43 : Localisation sub-cellulaire des différents mutants de Tspan5
Analyse de la localisation par microscopie à fluorescence de cellules HeLa transfectées transitoirement avec les mutants de Tspan5 étiquetés GFP.
Figure 44 : ADAM10 n’est pas nécessaire pour l’adressage de Tspan5 à la surface
cellulaire
Des MEF (Mouse Embryonic Fibroblasts) issus de souris KO pour ADAM10 ont été transfectées transitoirement avec Tspan5-GFP et sa localisation a été étudiée par microscopie à fluorescence.
La mutation des résidus RDD du motif RDDxDLQ ou NIYF entraine la perte d’interaction avec ADAM10 et la rétention dans le RE. Même si la possibilité d’un défaut de conformation ne peut être exclu, l’interaction de Tspan5 avec ADAM10 pourrait être nécessaire pour l’adressage de Tspan5 à la membrane. Pour tester cette hypothèse, des fibroblastes issus de souris KO pour ADAM10 ont été transfectés transitoirement avec Tspan5-GFP et sa localisation a été étudiée par microscopie à fluorescence (figure 44). Tspan5 est normalement exprimé à la surface cellulaire, indiquant que l’expression d’ADAM10 n’est pas nécessaire au trafic de Tspan5 vers la membrane plasmique.
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