Chapitre III : Physiologie des cellules souches /progéniteurs cardiaques
3 Rôles des canaux ioniques dans la régulation de la prolifération et/ou la différenciation des
3.1 Prolifération
Les canaux ioniques jouent un rôle important dans le contrôle de la prolifération cellulaire (MacFarlane and Sontheimer, 2000; Pardo, 2004). Dans les CSMs de la moelle osseuse de rat, il a été montré que durant la transition G1/S du cycle cellulaire, le courant IKDR diminue tandis que le courant IKCa augmente dans les MSC dérivés de la moelle osseuse
de rat (Deng et al., 2007).
De plus, l’e ti tio des a au IKDR ou les a au IKCa avec des siRNA ciblant KV1.2 et
KV2.1 (pour IKDR) ou KCa3.1 (pour IKCa) inhibe la prolifération cellulaire et provoque
l’a u ulatio des ellules e phase G / G du le, e ui sugg e ue es deux canaux sont nécessaires à la régulation de la prolifération cellulaire de ces cellules (Deng et al., 2007;
74 Wang et al., 2008). Le blocage du canal responsable du courant IKDR réduit considérablement la prolifération des cellules CSEs murines et humaines (Wang et al., 2005), et celle des CSMs humaines du tissu adipeux (Bai et al., 2007) mais pas la prolifération des CSC c-kit+ murines
(Han et al., 2010). Cependant, l'inhibition de IKDR favorise la prolifération de cellules progénitrices neurales adultes de rat (Liebau et al., 2006; Yasuda and Adams, 2010; Yasuda et al., 2008) et celle des progéniteurs neuronaux humains (Schaarschmidt et al., 2009).
De même, le blocage de IKCa réduit également la prolifération cellulaire dans les CSMs murines de la moelle osseuse avec une accumulation des cellules dans la phase G0 / G1 du cycle (Tao et al., 2008). Cependant, dans les CSMs humaines du tissu adipeu l'i hi itio d’IKCa n'a pas d'effet inhibiteur sur la prolifération cellulaire (Bai et al., 2007).
L'effet régulateur de BKCa sur la prolifération a été reporté dans plusieurs types
cellulaires. L'inhibition de BKCa réduit la prolifération cellulaire des pré-adipocytes humains
(Hu et al., 2009) et celle des cellules ES murins (Wang et al., 2005) mais pas celle des CSMs humaines du tissu adipeux (Bai et al., 2007). Cependant, l'inhibition de BKCa réduit la
p olif atio ellulai e et p o o ue l’a t du le e phase G /G da s les CSMs humaines de la moelle osseuse (Zhang et al., 2014b). De la e a i e, l’i hi itio de BKCa réduit la
prolifération en accumulant les cellules en phase G0/G1 dans les CSCs c-kit+ humaines (Zhang
et al., 2015b). Le canal Cl- sensible au volume a été impliqué dans la prolifération cellulaire et
l'apoptose de plusieurs types cellulaires (Blackiston et al., 2009; Lang et al., 2006; Liu et al., 2010). L’i hi itio de ICl. ol duit ota le e t la p olif atio ellulai e des CSMs murines (par accumulation des cellules en phase G0/G1) en inhibant la cycline D et la cycline E (Tao et al., 2008). De même, le blocage du canal ICl.vol diminue également la prolifération cellulaire des CSC c-kit+ murines (Han et al., 2010). L’h pe pola isatio de la e a e est i pli u e
da s l’i hi itio de la p olif atio ellulai e (Hu et al., 2009; Kuhlmann et al., 2005).
Dans les cellules progénitrices neuronales adultes, la dépolarisation membranaire par l’i hi itio de IKi ou par l'augmentation de la concentration de K+ extracellulaire favorise la
prolifération cellulaire (Yasuda et al., 2008). Cepe da t l’i hi ition du canal Kir2.1 dans les CSCs c-kit+hu ai es ’affe te pas la p olif atio ellulai e (Zhang et al., 2015b). Concernant
le rôle du courant Ito dans la prolifération, des études ont montré que l'activation du courant
IA (KV4.2) est une condition requise pour la prolifération dans les cellules progénitrices
Introduction
75 KV4.2 réduit la prolifération cellulaire dans les préadipocytes humains (Hu et al., 2009). Une
tude e te a o t ue l’i hi itio des a au TRPV et TRPV da s les C“Cs -kit+
humaines réduit la prolifération cellulai e pa l’a u ulatio des ellules e phase G /G du cycle cellulaire.
Le rôle précis des canaux Na+ TTX sensibles et les canaux Na+ TTX résistants (Na V1.5),
connus pour jouer un rôle fondamental dans la génération du potentiel d'action dans les ellules e ita les, ’est pas totale e t lu id da s les ellules o -excitables y compris les cellules souches (Cai et al., 2004; Li et al., 2005). Dans les CSMs humaines du tissu adipeux, le blocage de l'INa n'affecte pas la prolifération cellulaire (Bai et al., 2007). De e, l’i hi itio des canaux Na+ TTX sensibles dans les CSCs c-kit+ ’a pas d’i pa t su leu p olif atio (Zhang
et al., 2015b).
3.2 Différenciation :
Co e o u p de e t, l’a ti it al i ue tosoli ue est u iale pou la croissance et la progression dans le cycle cellulaire des cellules souches et des progéniteurs (Ferreira-Martins et al., 2009; Resende et al., 2010).
L’i hi itio des a au Ca2+ de type L réduit la différenciation des cellules progénitrices
neurales dérivées du cortex cérébral de souris D’As e zo et al., . De plus, l'entrée Ca2+
médiée par TRPC1 favorise la différenciation des CSEs neurales de rat(Fiorio Pla et al., 2005). L’i hi itio de TRPC ais pas TRPC a e des siRNA di i ue la diff e iatio des ellules progénitrices neurales de rat (Shin et al., 2010). Ces résultats suggèrent que la régulation du Ca2+ cytosolique par les canaux Ca2+ de type L, TRPC1 ou TRPC5 joue un rôle important dans la
transition entre la prolifération et la différenciation neuronale. Dans les CSMs humaines de la oelle osseuse l’i hi itio des a au BKCa ou hEag1 réduit la différenciation adipogénique et
ostéogénique de ces cellules (Zhang et al., 2014b).
En résumé, su les ellules sou hes a dia ues o e su d’aut e t pe de ellules souches les propriétés du signal calcique (fréquence amplitude, répartition spatio-temporelle, microdomaines) conditionneraient les propriétés cellulaires des cellules souches (différenciation, auto-renouvellement, prolifération migration). Ce signal conditionnerait l’e p essio de o euses p ot i es e pa ti ulie les a au io i ues.
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POSITION DU PROBLEME
Le œu hu ai a t o sid pe da t lo gte ps o e u o ga e post-mitotique sans aucune régénération et dans lequel les cardiomyocytes présents à la naissance persisteraient tout au long de la vie sans divisions cellulaires. La seule réponse majeure aux do ages a dia ues se ait l’h pe t ophie des a dio o tes e o e viables (Chien and Olson, 2002; MacLellan and Schneider, 2000; Soonpaa and Field, 1998). Ce dogme selon lequel le myocarde est vu comme un tissu statique commençait à être contesté avec les découvertes chez l’a i al etta t e ide e des di isio s itoti ues da s les a dio o tes (McDonnell and Oberpriller, 1984; Rumyantsev and Borisov, 1987). D’aut es do es o t o t l’e iste e de o tes e t i ulai es e di isio hez l’Ho e da s des o ditio s normales et pathologiques (Beltrami et al., 2001; Kajstura et al., 1998; Quaini et al., 2002). Cette ou elle isio du œu o e ta t u o ga e d a i ue i pli ue ait la p se e d’u e populatio de ellules p og it i es ou de ellules sou hes a dia ues à pa ti desquelles les nouveaux myocytes peuvent être formés.
En effet, plusieurs équipes ont is e ide e l’e iste e de ellules sou hes a dia ues C“Cs ultipote tes da s le œu hu ai sai et pathologi ue, apa les de se différencier en myocytes, cellules musculaires lisses et en cellules endothéliales (Messina et al., 2004; Urbanek et al., 2005). Cette découverte de CSCs a ouvert un nouveau domaine de recherche sur les mé a is es de l’ho ostasie et de la g atio a dia ue et a pe is d’e isage des th apies ellulai es à ase de C“Cs. Depuis, différents types de cellules ayant des propriétés souches ont été isolées à partir des tissus cardiaques humains et proposées comme modèles de CSCs (Barile et al., 2007; Guan and Hasenfuss, 2013). Ces CSCs portent plusieu s o e latu es, ui o espo de t à des a ueu s u’elles e p i e t, o e pa exemple les CSCs Isl-1+, les CSCs Sca-1+ ou les CSCs c-kit+.
Récemment, u e ou elle populatio de C“Cs d’o igi e se h ateuse a t d ou e te da s le œu hu ai (Reus et al., 2016; Zhang et al., 2015a). Ces cellules expriment des facteurs de transcription spécifiques cardiaques et peuvent être différenciées en plusieurs types cellulaires notamment en « cardiomyocytes ». Cependant, cette différenciation est incomplète et aboutit à des cardiomyocytes très immatures.
77 Les CSCs W8B2+ possèdent des capacités réparatrices cardiaques importantes
lo s u’elles so t i je t es da s des od les u i s d’i fa tus du o a de (Reus et al., 2016; Rossini et al., 2011). Cette capacité réparatrice cardiaque serait liée au large sécrétome que possède ces cellules qui est composé de cytokines et de facteurs de croissance intervenant notamment dans l'angiogenèse, la survie cellulaire, le chimiotactisme, la réponse i u itai e, l’i fla atio et le e odelage e t a ellulai e (Reus et al., 2016; Zhang et al., 2015a).
N a oi s, au u e a a t isatio fo tio elle à l’ helle ellulai e (électrophysiologie, signalisation calcique au cours la différenciation… ’a t appo t e. Ainsi, les objectifs de ces travaux consistent à :
Mettre au point un modèle de CSCs humaines exprimant le marqueur W8B2+ à partir
d’ ha tillo s au i ulai es hu ai s o te us e olla o atio a e le CHU de Poitie s. Caractériser la signature électrophysiologique (canaux ioniques et signalisation
al i ue à l’ tat sou he et ap s diff enciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+.
Améliorer la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ in vitro par optogénétique.
Suivre les changements calciques au cours de cette différenciation via l’utilisatio de la sonde calcique GCaMP.
En parallèle de ces objectifs, nous avons étudié sur ce modèle cellulaire deux types de cibles, un canal calcium dépendant et un médiateur lipidique, soient:
l’i po ta e des a au io i ues plus p is e t le a al BKCa) dans la régulation
des propriétés fondamentales (prolifération et auto-renouvellement) des CSCs W8B2+.
les effets et le ode d’a tio de la sphi gosi e -phosphate (un important régulateur physiologique et physiopathologique cardiaque) sur les propriétés des CSCs W8B2+
78 MATERIELS ET METHODES
I- Isolement et purification des CSCs W8B2+à pa ti d’ ha tillo s hu ai s d’o eillettes