Dans ce modèle d'angiogenèse in vitro, il a été préalablement montré que la tubulogenèse des cellules endothéliales bovines pouvait être induite par divers membres de la famille des VEGF (Pepper et al., 1992; Pepper et al., 1998). Le profil d'expression des VEGFR exprimés par ces cellules est connu, VEGFR-1 et VEGFR- 2 sont exprimés par les BME et les BAE, tandis que VEGFR-3 est présent uniquement dans les BAE (Pepper and Mandriota, 1998; Pepper et al., 1998). Afin de distinguer le ou lesquels de ces récepteurs sont nécessaires au processus d'angiogenèse in vitro et à l'induction du système des activateurs du plasminogène par la famille des VEGF, j'ai choisi de stimuler chaque VEGFR individuellement grâce à des ligands spécifiques, obtenus par mutagenèse.
Dans le modèle d'angiogenèse in vitro les ligands activant VEGFR-1, comme PlGF, VEGF-B167/186 et VFM17, n'induisent pas l'invasion des cellules endothéliales. Par
contre, les ligands de VEGFR-2, le VEGF-A et le VFM23A, induisent une angiogenèse in vitro de même intensité. Le synergisme entre FGF-2 et VEGF-A n'est pas induit par les ligands de VEGFR-1, mais uniquement part ceux de VEGFR-2, VEGF-A, VFM23A, VEGF-C, VEGF-C152. De plus, un anticorps neutralisant VEGFR-
1 n'affecte pas l'invasion induite par VEGF-A dans les deux lignées de cellules endothéliales (résultats non publiés). Ces résultats suggèrent que VEGFR-1 n'est pas impliqué dans la tubulogenèse induite par VEGF-A dans ce modèle d'angiogenèse in vitro. Par contre, il a récemment été publié que VEGFR-1 pourrait intervenir dans l'angiogenèse induite par FGF-2 (Kanda et al., 2004).
L'utilisation de ligands spécifiques pour VEGFR-2 et/ou VEGFR-3, tel que VEGF-A, VFM23A, VEGF-C et VEGF-C152, induisent une réponse similaire en terme
d'angiogenèse in vitro. Ces résultats sont accord avec les données récentes de la littérature concernant le rôle primordial de VEGFR-2 dans la réponse biologique des cellules endothéliales suite à l'activation par VEGF-A.
Par contre, les cytokines mutantes, VEGF-C156 et VEGF-C152, liant spécifiquement
VEGFR-3 humain induisent une réponse angiogénique différente. VEGF-C152 est
aussi actif que VEGF-C, tandis que VEGF-C156 est inactif. Ce résultat m'a amené à
rechercher si le profil de liaison de ces deux mutants à VEGFR-3 est conservé dans les cellules endothéliales d'origine bovine. VEGF-C156 n'induit pas la phosphorylation
de VEGFR-3 bovin, ni de VEGFR-2, tandis que VEGF-C152 active VEGFR-2 bovin en
plus de VEGFR-3 comme le VEGF-C. Ces résultats indiquent d'une part qu'il existe une interaction ligand-récepteur qui est spécifique selon les espèces et renforce l'importance de VEGFR-2 dans nos cellules endothéliales.
L'augmentation transitoire de l'ARN messager des activateurs du plasminogène (t- PA, u-PA), de u-PAR et de PAI-1, est uniquement induite par les ligands de VEGFR- 2 et/ou VEGFR-3, tel que VEGF-A, VFM23A et VEGF-C. Dans les BAE, qui expriment VEGFR-2 et -3, t-PA est plus fortement induit par VEGF-C que par VEGF- A. Par contre, les BME, qui n'expriment pas VEGRFR-3, t-PA est induit plus fortement par VEGF-A que par VFM23A et VEGF-C. Ces résultats montrent d'une part que VEGFR-1 n'intervient pas dans l'induction des activateurs du plasminogène, mais d'autre part ils indiquent aussi qu'il existe une différence entre les BAE et les BME dans la régulation de t-PA. Celle-ci pourrait résider dans une différence d'expression des VEGFR ou de co-récepteur, comme les neuropilins. Afin de démonter que VEGFR-1 ne joue aucun rôle dans l'invasion et la régulation d'expression de gènes dans les BME et les BAE, il faudrait s'assurer que celui-ci est bien phosphorylé suite à l'ajout de VEGF-B167/186 et PlGF.
Afin de clairement distinguer l'activité de VEGF-C par VEGFR-2 et VEGFR-3, j'ai utilisé des anticorps monoclonaux neutralisant VEGFR-2 et VEGFR-3 dans le modèle d'angiogenèse in vitro. L'angiogenèse induite par VEGF-A est totalement inhibée par les anticorps neutralisant VEGFR-2, confirmant les données obtenues à
l'aide des inhibiteurs de la phosphorylation. L'anticorps neutralisant VEGFR-3 n'affecte pas l'invasion induite par VEGF-A (Persaud et al., 2004). Ces résultats démontrent que, dans les cellules endothéliales bovines, l'activité de VEGF-A se fait uniquement par l'intermédiaire de sa liaison à VEGFR-2. La tubulogenèse induite par VEGF-C et VEGF-C152 n'est que partiellement inhibée par les anticorps neutralisant
VEGFR-2 ou VEGFR-3. L'addition conjointe des anticorps anti-VEGFR-2 et anti- VEGFR-3 permet d'inhiber totalement l'angiogenèse in vitro induite par VEGF-C (Persaud et al., 2004). Ces résultats démontrent que VEGF-C induit l'invasion des cellules endothéliales bovines par l'activation de VEGFR-2 ainsi que de VEGFR-3. De plus, l'activation simultanée des deux récepteurs permet de potentialiser la réponse induite par VEGF-C. Récemment, il a été reporté la formation d'hétérodimère fonctionnel composé de VEGFR-2 et VEGFR-3, suite à la stimulation par VEGF-C (Dixelius et al., 2003). Cette potentialisation pourrait s'expliquer par la formation d'hétérodimère VEGFR-2/-3, mais également par une modification des voies de signalisation intra-cellulaire.
L'utilisation d'un inhibiteur de la phosphorylation des trois VEGFR, le SU5416, bloque totalement l'angiogenèse in vitro induite par VEGF-A et VEGF-C. En ce qui concerne les BAE, j'ai observé que VEGF-A induit une plus forte phosphorylation de VEGFR-2 que VEGF-C. Par contre, l'activation de la voie de signalisation des MAPkinase, ERK1 et ERK2, qui participe à la prolifération cellulaire, est moins fortement activée par VEGF-A que par VEGF-C. Ces résultats soutiennent l'hypothèse qu'il existe une différence d'activation de voies signalétiques suite à la phosphorylation de VEGFR-2 par VEGF-A et VEGF-C.
En conclusion de cette étude, j'ai démontré l'importance de l'activation de VEGFR-2 dans l'angiogenèse induite par VEGF-A et VEGF-C dans les BAE. De plus, l'activité complète de VEGF-C nécessite l'activation simultanée de VEGFR-3 et de VEGFR-2. Par contre, VEGFR-2 qui est activé par VEGF-A et VEGF-C dans les BME n'est pas suffisant pour permettre l'angiogenèse in vitro induite par VEGF-C. Ceci suggère de nouveau un rôle pour les neuropilins, des co-récepteurs aux VEGF, dans la capacité angiogénique des cellules endothéliales.