Rôle des sécrétions de protéines dans la protection de la mu

nos clones 3D7 e Dd2 na presença de cloroquina

Esta fase do trabalho teve como objectivos identificar eventuais diferenças ao nível da expressão dos genes de resposta ao stress oxidativo e das prováveis bombas de efluxo codificadas pelos genes pfmrp1 e pfmrp2, comparando parasitas sensíveis (3D7 CQS) e resistentes (Dd2 CQR) na presença (em concentração correspondente ao IC50 de cada clone) e ausência de CQ. A diferença de expressão dos genes em cultura sem CQ e na presença de CQ é dada pelo valor de Nfold (determinado segundo a equação N=2−(Ct,alvo−

Ct, contolo interno)χ− (Ct,alvo− Ct, contolo interno)γ _{onde χ corresponde à amostra tratada com CQ}

(IC50) e γ à amostra não tratada), nos clones 3D7 e Dd2. Nfold corresponde ao número de vezes que determinado gene se expressa mais ou menos, na amostra tratada do que

na amostra não tratada com a CQ. Para o presente estudo consideramos que existiu diferença de expressão quando o valor de Nfold é superior a 1,5. Os resultados dos valores de Nfold e os respectivos desvios padrão, encontram-se na Figura III 16 e Figura III 17

Para os 10 genes em estudo e em ambos os clones, ocorreu aumento significativo da expressão na presença de CQ. Sendo que a amplitude de variação de expressão dos genes é significativamente mais elevada no clone 3D7 (CQS) do que no Dd2 (CQR). Não foi verificada em geral diminuição significativa da expressão dos genes em presença de CQ.

A variação da amplitude de expressão induzida pela CQ em ambos os clones parece seguir 4 padrões distintos; contínua (CT), descontínua (DT), difásica (DF) e trifásica (TF). Seguindo este padrão agrupamos os genes da seguinte forma: CT - pfgpx e

pfmrp2; DT - pftrxR; DF - pfFe-sod, pfgst, pf2-cysPx e pfmrp1; TF - pfγ-gcs, pfgr, pfg6pd. No clone Dd2, pfg6pd comporta-se como contínua pois apesar de serem

observáveis 3 fases distintas (em que a expressão aumenta), a amplitude de variação não atinge o nível de significância previamente estabelecido de 1,5 vezes.

a) pfFe-sod

Para o clone 3D7 (CQS) os valores de Nfold indicam um aumento da expressão de pfFe-

sod na fase de anel, o qual se mantém durante a fase de trofozoíto, decrescendo à

medida que os trofozoítos passam ao estadio de esquizonte, onde obtivemos os valores mais baixos de alteração de expressão deste gene, na presença de CQ. A expressão aumenta de novo à medida que o parasita passa para o estadio de merozoíto (Figura III.16). Os valores de expressão variam entre 1,6 e ≈ 9 vezes mais na presença de CQ. Pelo contrário no clone Dd2 (CQR), não foi detectada alteração significativa da expressão de pfFe-sod em resposta à presença de CQ Figura III.17.

1,5 pfFesod 6 8 10 12 1416 18 20 22 24 2628 30 32 34 3638 40 42 44 46 1 2 4 8 1,5 Hrs N fo ld 1,5 pfγ-GCS 6 8 10 12 1416 18 20 2224 26 28 3032 34 36 38 4042 44 46 1 2 4 8 1,5 Hrs N f o ld 0,6 1,5 pfgr 6 8 10 12 14 16 1820 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 4 0,6 1,5 Hrs N f o ld 1,5 pfgst 6 8 10 12 14 16 1820 22 24 2628 30 32 34 3638 40 42 44 46 1 2 4 1,5 hrs N fo ld 1,5 pfgpx 6 8 10 12 1416 18 20 22 24 2628 30 32 34 36 38 4042 44 46 1 2 4 8 1,5 TP N f o ld 0,6 1,5 pftrxR 6 810121416182022242628303234363840424446 0.125 0.25 0.5 1 2 4 0,6 1,5 Hrs N f o ld 0,6 1,5 pf2-CysPx 6 8 10 1214 16 18 20 2224 26 28 30 32 3436 38 40 42 4446 0.5 1 2 4 0,6 1,5 Hrs N f o ld 1,5 pfg6pd 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 1 2 4 8 16 1,5 TP N f o ld 0,6 1,5 pfmrp1 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 3436 3840 42 44 46 0.5 1 2 4 8 0,6 1,5 Hrs N f o ld 1,5 pfmrp2 6 8 10 12 14 16 1820 22 24 2628 30 32 34 3638 40 42 44 46 1 2 4 8 1,5 Hrs N f o ld

3D7

Figura III.16 - Alteração da expressão dos genes de enzimas de resposta ao stress oxidativo, pfmrp1 e pfmrp2 ao longo do ciclo intra-eritrocitário do clone 3D7 na presença de cloroquina. No eixo dos Y está representado em escala semi-logarítmica o valor de

Nfold (variação da expressão génica) ao longo do ciclo na presença de CQ. O valor 1 indica ausência de

alteração da expressão por efeito da CQ. Os valores fora das linhas a tracejado (entre 0,6 e 1,5) indicam aumento ou diminuição da expressão. Hrs representa a hora após invasão. Anel (0-22 h), Trofo. trofozoíto (22-34 h), Esqui. esquizonte (34-42h). Mero. merozoíto (44-46h).

0,6 1,5 pfFe-SOD 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 0,6 1,5 Hrs Nf o ld 1,5 pfγ-GCS 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 1 2 4 1,5 Hrs Nf o ld 0,6 1,5 pfGR 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 4 0,6 1,5 Hrs Nf o ld 0,6 1,5 pfGST 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 0,6 1,5 Hrs Nf o ld 0,6 1,5 pfGPX 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 0,6 1,5 Hrs Nf o ld 0,6 1,5 pfTrxR 4 6 8 1012 1416 1820 22 2426 28 3032 3436 38 4042 4446 0.5 1 2 4 8 0,6 1,5 Hrs Nf ol d 1,5 pf2-CysPx 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 1 2 4 1,5 Hrs Nf o ld 0,6 1,5 pfG6PD 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 4 0,6 1,5 Hrs Nf o ld 0,6 1,5 pfMRP1 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.25 0.5 1 2 4 0,6 1,5 Hrs Nf ol d 0,6 1,5 pfMRP2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 0.5 1 2 4 0,6 1,5 Hrs Nf o ld

Dd2

Figura III.17 - Alteração da expressão dos genes de enzimas de resposta ao stress oxidativo, pfmrp1 e pfmrp2 ao longo do ciclo intra-eritrocitário do clone Dd2 na presença de cloroquina. No eixo dos Y está representado em escala semi-logarítmica o valor de

Nfold (variação da expressão génica) ao longo do ciclo na presença de CQ. O valor 1 indica ausência de

alteração da expressão por efeito da CQ. Os valores fora das linhas a tracejado (entre 0,6 e 1,5) indicam aumento ou diminuição da expressão. Hrs representa a hora após invasão. Anel (0-22 h), Trofo. trofozoíto (22-34 h), Esqui. esquizonte (34-42h). Mero. merozoíto (44-46h).

b) pfγ-gcs

Em ambos os clones os valores de Nfold indicam um aumento da expressão de pfγ-gcs ao longo de todo o ciclo intra-eritrocitário, excepto na fase de anel em Dd2 (Figura III.17). Embora a tendência seja a mesma, de aumento de expressão na presença de fármaco, a amplitude de variação é maior em 3D7 (≈ 4 vezes) (Figura III.16) do que em Dd2 onde esta variação apenas ultrapassa pontualmente as duas vezes mais.

c) pfgr

Os valores de Nfold indicam um aumento da expressão deste gene com um padrão idêntico ao de pfγ-gcs para o clone 3D7 (Figura III.16), embora com menor amplitude. Para o clone Dd2 as variações de expressão atingem valores significativos apenas pontualmente, na fase de anel (Figura III.17). Embora se verifique uma tendência para o aumento de expressão na presença de fármaco, a amplitude de variação é maior em 3D7 (≈ 3 vezes) do que em Dd2, onde esta variação ultrapassa as duas vezes mais, apenas pontualmente.

d) pfgst

Para o clone 3D7 os valores de Nfold indicam um aumento da expressão de pfgst na fase de anel, o qual se mantém durante a fase de trofozoíto, decrescendo à medida que os trofozoítos passam ao estadio de esquizonte onde foram obtidos os valores mais baixos de alteração de expressão deste gene na presença de CQ. A expressão aumentou de novo à medida que o parasita passa para o estadio de merozoíto (Figura III.16). Os valores Nfold variam até ≈ 3 vezes, mas na generalidade não ultrapassam as duas vezes. Pelo contrário, no clone Dd2, não foi detectada alteração significativa da expressão de

pfgst em resposta à presença de CQ (Figura III.17).

e) pfgpx

Os valores de Nfold indicam um aumento da expressão de pfgpx na fase de anel, o qual se mantém durante a fase de trofozoíto, decrescendo à medida que os trofozoítos passam ao estadio de esquizonte onde obtivemos a menor amplitude de variação de expressão do referido gene na presença de CQ. A tendência da variação da expressão parece ser

decrescente à medida que o parasita se desenvolve atingindo um máximo na fase de anel de ≈ 9, decrescendo para valores não significativos (≤1,5) no final do ciclo intra- eritrocitário (Figura III.16). Pelo contrário no clone Dd2, não foi detectada alteração significativa da expressão de pfgpx em resposta à presença de CQ (Figura III.17).

f) pftrxR

Para pftrxR, o padrão de expressão, bem como a amplitude de variação de Nfold é idêntica na fase de anel (até às 18h) em ambos os clones 3D7 e Dd2. Sendo maior a amplitude no início e decrescendo para o final da fase de anel (Figura III.16 e Figura III.17). Em 3D7 este decréscimo é mais acentuado parecendo indicar uma inibição da expressão do gene, tendência que se inverte (sem atingir níveis de significância) na fase de esquizonte maduro e merozoíto (Figura III.16). Em Dd2 a expressão de pftrxR sofre também uma diminuição significativa durante as primeiras horas de trofozoíto, aumentando depois durante a restante fase de trofozoíto (≈ 4 vezes) e esquizonte (≈ 2 vezes), no estadio de merozoíto a expressão do gene baixa para níveis basais (Figura III.17).

g) pf2-cysPx

No clone Dd2 a expressão de pf2-cysPx está aumentada até ≈ 3 vezes, na fase de anel decrescendo à medida que os anéis se desenvolvem em trofozoítos. Na fase de trofozoíto os valores de Nfold mantêm-se entre 1,5 e 2. À medida que o parasita passa ao estadio de esquizonte a expressão aumenta para valores de N ≈ 3 vezes e mantém-se durante a fase de esquizonte até ao final do ciclo (Figura III.17). No clone 3D7, apenas se regista um aumento de expressão da ordem das 2 vezes na fase de esquizonte, as variações de expressão nos restantes estadios mantêm-se abaixo do limiar de significância (Figura III.16).

h) pfg6pd

Para o clone 3D7 os valores de Nfold indicam um aumento da expressão de pfg6pd na fase de anel que se mantém em valores Nfold ≈ 3, durante todo o estadio. Durante a fase de trofozoíto e esquizonte, também se regista um aumento de expressão relativamente constante e com valores de Nfold ≈ 4 (Figura III.16). No clone Dd2 a expressão deste

gene aumenta à medida que os esquizontes se desenvolvem, atingindo valores de Nfold ≈ 2 e decresce à medida que os esquizontes ficam maturos (Figura III.17).

i) pfmrp1

Para o clone 3D7 os valores de Nfold indicam um aumento da expressão de pfmrp1 durante o desenvolvimento dos anéis em trofozoítos. À medida que os trofozoítos se desenvolvem a expressão decresce a níveis de Nfold < 1,5 e volta a subir quando os parasitas se diferenciam em esquizontes atingindo valores de Nfold ≈ 4. A expressão baixa durante a diferenciação em merozoítos (Figura III.16). No clone Dd2 a expressão de pfmrp1 mantém-se em valores de Nfold < 1,5 (não varia pela presença de CQ) durante a fase de anel e trofozoíto jovem, quando os trofozoítos se desenvolvem, os níveis de expressão aumentam até os parasitas atingirem o estadio de esquizonte mantendo-se constantes (Nfold ≈ 4) (Figura III.17).

j) pfmrp2

Na fase de anel do clone Dd2, não se regista aumento de expressão até se iniciar a diferenciação para trofozoíto, enquanto que no clone 3D7 na fase de anel a expressão está aumentada decrescendo de Nfold ≈ 4 para ≈ 3 (Figura III.16 e Figura III.17 respectivamente). A partir da fase de anel e em ambos os clones, embora a tendência de variação seja a mesma, a amplitude de variação é maior em 3D7 (entre ≈ 3 a 4 na fase de trofozoíto e entre ≈ 4 a 6 na fase de esquizonte) do que em Dd2 (entre ≈ 1,5 a 2 na fase de trofozoíto e entre ≈ 2 a 3 na fase de esquizonte) (Figura III.16 e Figura III.17 respectivamente).

III.3.4.3 - Efeito da cloroquina na regulação da transcrição dos genes de enzimas