Rôle de la PLD dans l'atrophie

4.5.1.1 La modulation de l'expression de l'isoforme PLD1 a des effets trophiques

Activité créatine kinase, en unités relatives

Ad GFP Ad PLD1 Ad PLD2

Figure 41 : Effets de la surexpression et de la down-régulation de la PLD sur l’activité créatine kinase des myotubes L6.

A. Les cellules sont infectées par des adénovirus codant pour les 2 isoformes de PLD, ou par un adénovirus codant pour la GFP (contrôle) durant 2 jours. L’activité créatine kinase est mesurée sur les homogénats cellulaire, comme dans la figure 27. Les moyennes +/- SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en triple sont exprimées par rapport à la valeur contrôle. + : différent du contrôle, p< 0,01. B. Contrôle de surexpression des deux isoformes de PLD : Les cellules sont infectées avec les adénovirus correspondants, ou par l'adénovirus-GFP pendant 48h. Les taux de protéine sont ensuite évalués par Western blot grâce à un anticorps dirigé contre le tag HA présent sur les deux formes de PLD recombinantes. C. Les cellules sont transfectées pendant 48h par des ARNi anti-PLD1 ou anti-PLD2 ou ARNi contrôle, puis l’activité créatine kinase des homogénats est mesurée comme dans la figure 27. Les moyennes +/- SEM de 2 expériences indépendantes réalisées en triple sont exprimées par rapport à la valeur contrôle. * : différent du contrôle, p< 0,01. D.

Contrôle d’expression des deux isoformes de PLD : les cellules sont transfectées pendant 48h avec les ARNi anti-PLD1 ou anti-PLD2 ou contrôle puis le niveau d’expression ARN des deux isoformes est mesuré par

RT-4.5 Recherche des voies de signalisation impliquées 4. Résutats

qPCR quantitative. Les moyennes +/- SEM de 2 expériences en double sont exprimées par rapport à la valeur contrôle. * : différent du contrôle, p< 0,05 ;** : p<0,01.

Nous avons montré que la surexpression de l’isoforme 1 de PLD (PLD1), vérifiée par Western blot (figure 41B), induit une hypertrophie par elle-même, observée ici sur l’activité créatine kinase (figure 41A), tandis que la PLD2 n’a pas d’effet trophique. De manière cohérente, la down-régulation ARNi-induite de PLD1 a un effet atrophique mis en évidence par la baisse d'activité créatine kinase (figure 41C), alors que la down-régulation de PLD2 n’affecte pas significativement les myotubes. La régulation de l'expression de PLD1 ayant des effets trophiques dans les myotubes L6, cette enzyme constitue un bon candidat pour expliquer l’effet atrophique des céramides.

4.5.1.2 L’inhibition de PLD mime l’effet inducteur des céramides et du TNFα sur les atrogènes

Figure 42 : Effet de l'inhibiteur de la PLD, FIPI, sur l'expression des atrogènes.

Les taux d’ARNm de FoxO3, Atrogine-1 et MurF1 ont été mesurés par RT-qPCR dans des myotubes traités ou non avec le FIPI à 0,5 µM durant 48h. Les taux sont normalisés par l’ARNm de TBP (TATA box Binding Protein). Les moyennes +/- SEM de 4 mesures sont représentées. * : différent de contrôle, p< 0,05.

Nous avons déterminé les effets de l’inhibition de la PLD par un inhibiteur spécifique, le 5-Fluoro-2-indolyl des-chlorohalopémide (FIPI), actif sur les deux isoformes de PLD (Su et al. 2009). L’inhibition de la PLD chez des myotubes L6 induit une augmentation de l’expression des atrogènes (figure 42), comparable à celle induite par le TNFα (figure 40A), ce qui suggère qu’un même "programme atrophique" est activé par l'inhibition de PLD et par le TNFα.

4.5.1.3 L’action du TNFα passe par la down-régulation de la PLD

Le céramide est décrit comme un inhibiteur de l'expression de PLD1. La PLD est un activateur reconnu de la kinase mTOR, point de contrôle majeur de la synthèse protéique via ses effecteurs S6K1 et 4E-BP1, et régulateur de la protéolyse via son impact sur Akt et FoxO (Frost et Lang 2011). mTOR est vital dans l’homéostasie du muscle, pour l’intégration de signaux cataboliques ou anaboliques (Bentzinger et al. 2008). Nous avons donc recherché les effets du TNFα et des inhibiteurs de la synthèse de céramides sur cette cascade de signalisation dans les myotubes L6, en commençant par la PLD1.

Le TNFα induit une forte diminution de l’expression de l'ARNm de PLD1 (divisée par 4 par rapport au contrôle) (figure 43A barre 4). La myriocine n’a aucun effet par elle-même, et GW4869 augmente modérément son expression (figure 43A). Par contre, en présence de TNFα, la myriocine rétablit partiellement l’expression de la PLD1 et GW4869 la rétablit entièrement. Le blocage total de la synthèse de céramides par ajout simultané des deux inhibiteurs en présence de TNFα révèle un effet synergique puisqu’il augmente de manière spectaculaire le taux d’ARNm de PLD1 (3,5 x par rapport au contrôle et 14 x par rapport à TNFα seul).

Ces effets sont confirmés au niveau de la protéine, le TNFα induisant une baisse de la quantité de PLD1 qui est reversée par le traitement avec les inhibiteurs de la synthèse de céramides (figure 43B). Nous pouvons en déduire que le TNF down-régule PLD1, via la formation de céramides.

4.5 Recherche des voies de signalisation impliquées 4. Résutats

*

+

+

** ** ** **

**

*

¶

¶

A

B

Figure 43 : Effets du TNFα et des inhibiteurs de synthèse de céramide sur l'expression de PLD1.

Les myotubes sont traités pendant 3 jours avec du TNFα en présence ou non d’inhibiteurs : myriocine 100 nM, GW 10 µM, ou les deux. A. Les taux d’ARNm de PLD1 ont été mesurés par RT-qPCR et normalisés par l’ARNm de TBP (TATA box Binding Proteine). Les moyennes +/- SEM de 3 expériences indépendantes en double sont représentées. * : différent de TNFα seul, p≤ 0,05, ** : p<0,001.¶ : différent de contrôle, p≤ 0,05. B. La protéine PLD1 est analysée par Western blot après immuno-précipitation. Les résultats sont normalisés par la tubuline.

Les moyennes +/- SEM de 3 expériences indépendantes sont représentées. * : différent de contrôle, p≤ 0,01, ** : différent de TNFα, p=0,02.

4.5.1.4 L’acide phosphatidique (PA), produit de la PLD, s’oppose à l’action atrophique du TNFα

Pour confirmer l'implication de la PLD dans les effets du TNFα, nous avons étudié les effets de son produit PA. L’ajout de PA exogène dans le milieu de culture, qui mime une activation de PLD, permet de s’opposer à l’effet négatif du TNFα sur l’activité créatine kinase (figure 44). Ceci confirme que le TNFα provoque une altération de la signalisation par la PLD, responsable de ses effets atrophiques.

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00

contrôle TNFα PA 100µM TNF+PA50 TNF+PA100

Activité Créatine kinase, U/L

** **

++

Figure 44 : Effets de l'acide phosphatidique exogène sur l'activité créatine kinase.

Les cellules sont traitées avec ou sans TNFα, en présence ou non de dioctanoyl-PA à 50 µM ou 100 µM.

L'activité créatine kinase des homogénats cellulaires est dosée comme dans la figure 27. Les moyennes +/- SEM de 3 expériences indépendantes dosées en triples sont exprimées en unités enzymatiques par litre. ** : différent de TNFα, p≤ 0,01.